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Study of the interactions of surface-modified particles with membrane model systems
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Resumo(s)
The complexity of cell membranes and the development of nano/micro drug delivery systems make the topic of interactions between these two structures challenging. Studies point that the surface properties of these carriers like size, surface charge, shape and hydrophobicity largely influence such interactions. This project aims to study the interactions of surface modified Poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) Microparticles (MPs) with Giant Unilamellar Vesicles (GUVs). MPs were formulated by the double emulsion solvent evaporation method and surface modified using chitosan (CH) and alginate (ALG) in order to manipulate the surface charge. Five concentrations of coumarin-6 (0.04, 0.10, 0.20, 0.40 and 1.00 g/mg) were entrapped into the PLGA matrix, after formulation optimization without probe. Phisichochemical characterization of MPs was made in terms of size, surface charge, coumarin-6 loading and morphology. Spectral properties of coumarin-6 were analyzed by fluorescence spectroscopy with the five different probe concentrations and five concentrations of MPs in suspension (0.10, 0.20, 0.25, 0.40, and 0.50 mg/mL). GUVs with different lipid composition and membrane properties, namely, homogeneously fluid GUVs and GUVs displaying gel-fluid and lo-ld phase separation were produced. Confocal microscopy was used to monitor the possible interactions between coumarin-6-loaded PLGA MPs and GUVs. MPs size (D50%) of non-fluorescent and fluorescent coumarin-6-loaded PLGA MPs ranged between 1.4±0.3 to 3.8±0.2 μm. The span values ranged between 1.1±0.2 to 4.8±1.1, demonstrating polidisperse populations. The surface modification did not demonstrate a statistically significant impact on the D50% values. In addition, the presence of coumarin-6 did not demonstrate a statistically significant impact on the D50% values, except for PLGA ALG MPs loaded with 0.4 and 1.0 μg/mL of coumarin-6 (p < 0.01). As expected, the surface modification produced a statistically significant impact on the surface charge (p < 0.001). Negative surface charges were displayed for non-fluorescent and fluorescent PLGA PVA MPs (-17.8±0.9 to -19.9±0.2 mV) and for non-fluorescent and fluorescent PLG ALG MPs (-30.8±2.3 to -36.8±4.4 mV). PLGA MPs containing CH PLGA showed a highly positive surface charge (50.8±2.7 and 58.7±3.4 mV). The presence of coumarin-6 did not demonstrate statistically significant impact on surface charge. Spectral studies showed that once increasing the MPs concentration in suspension no spectral changes were detected, suggesting that coumarin-6 did not change the partition environment to the surface and so remains on the hydrophobic matrix. In addition, this observation was further supported by the mainly linear variation of fluorescence intensity maximum upon increasing the concentration of the coumarin-6-loaded PLGA-C6 MPs, independently of their surface modification. At coumarin-6 concentrations above 0.2 µg/mg, the increase of the non-encapsulated molecules localized in the surface of the MPs or even aqueous medium was mainly evidenced by the decrease of anisotropy values. Regardless of MP composition, the red shift in probe emition of an aproximately 15 nm once increasing probe concentration from 0.04 to 1.00 The complexity of cell membranes and the development of nano/micro drug delivery systems make the topic of interactions between these two structures challenging. Studies point that the surface properties of these carriers like size, surface charge, shape and hydrophobicity largely influence such interactions. This project aims to study the interactions of surface modified Poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) Microparticles (MPs) with Giant Unilamellar Vesicles (GUVs). MPs were formulated by the double emulsion solvent evaporation method and surface modified using chitosan (CH) and alginate (ALG) in order to manipulate the surface charge. Five concentrations of coumarin-6 (0.04, 0.10, 0.20, 0.40 and 1.00 g/mg) were entrapped into the PLGA matrix, after formulation optimization without probe. Phisichochemical characterization of MPs was made in terms of size, surface charge, coumarin-6 loading and morphology. Spectral properties of coumarin-6 were analyzed by fluorescence spectroscopy with the five different probe concentrations and five concentrations of MPs in suspension (0.10, 0.20, 0.25, 0.40, and 0.50 mg/mL). GUVs with different lipid composition and membrane properties, namely, homogeneously fluid GUVs and GUVs displaying gel-fluid and lo-ld phase separation were produced. Confocal microscopy was used to monitor the possible interactions between coumarin-6-loaded PLGA MPs and GUVs. MPs size (D50%) of non-fluorescent and fluorescent coumarin-6-loaded PLGA MPs ranged between 1.4±0.3 to 3.8±0.2 μm. The span values ranged between 1.1±0.2 to 4.8±1.1, demonstrating polidisperse populations. The surface modification did not demonstrate a statistically significant impact on the D50% values. In addition, the presence of coumarin-6 did not demonstrate a statistically significant impact on the D50% values, except for PLGA ALG MPs loaded with 0.4 and 1.0 μg/mL of coumarin-6 (p < 0.01). As expected, the surface modification produced a statistically significant impact on the surface charge (p < 0.001). Negative surface charges were displayed for non-fluorescent and fluorescent PLGA PVA MPs (-17.8±0.9 to -19.9±0.2 mV) and for non-fluorescent and fluorescent PLG ALG MPs (-30.8±2.3 to -36.8±4.4 mV). PLGA MPs containing CH PLGA showed a highly positive surface charge (50.8±2.7 and 58.7±3.4 mV). The presence of coumarin-6 did not demonstrate statistically significant impact on surface charge. Spectral studies showed that once increasing the MPs concentration in suspension no spectral changes were detected, suggesting that coumarin-6 did not change the partition environment to the surface and so remains on the hydrophobic matrix. In addition, this observation was further supported by the mainly linear variation of fluorescence intensity maximum upon increasing the concentration of the coumarin-6-loaded PLGA-C6 MPs, independently of their surface modification. At coumarin-6 concentrations above 0.2 µg/mg, the increase of the non-encapsulated molecules localized in the surface of the MPs or even aqueous medium was mainly evidenced by the decrease of anisotropy values. Regardless of MP composition, the red shift in probe emition of an aproximately 15 nm once increasing probe concentration from 0.04 to 1.00 µg/mg also account that observation. Studies on the MPs-membranes interaction studies were performed under the following experimental conditions: i) concentration of coumarin-6 0.2 µg/mg and ii) MPs concentration 0.25 mg/mL. Data showed that highly positive PLGA CH-C6-3 MPs and highly negative PLGA ALG-C6-3 MPs interacted with GUVs and were mainly directed to the gel phase and interface of fluid-gel phases. Results show that the MP surface modification plays an important role on surface charge. Entrapment of the fluorescent dye coumarin-6 conducts to a probe/MPs stable system. It was demonstrated that surface charge and biophysical membrane behaviour are important on interactions of surface modified MPs and GUVs. g/mg also account that observation. Studies on the MPs-membranes interaction studies were performed under the following experimental conditions: i) concentration of coumarin-6 0.2 µg/mg and ii) MPs concentration 0.25 mg/mL. Data showed that highly positive PLGA CH-C6-3 MPs and highly negative PLGA ALG-C6-3 MPs interacted with GUVs and were mainly directed to the gel phase and interface of fluid-gel phases. Results show that the MP surface modification plays an important role on surface charge. Entrapment of the fluorescent dye coumarin-6 conducts to a probe/MPs stable system. It was demonstrated that surface charge and biophysical membrane behaviour are important on interactions of surface modified MPs and GUVs.
Os avanços feitos na área do transporte de agentes terapêuticos têm-se focado no desenvolvimento de sistemas à escala nano/micrométrica. Uma das vantagens desses sistemas promissores prende-se com a sua específicidade e eficiência na entrega do agente terapêutico à célula, tecido ou órgão alvo, permitindo a manutenção da concentração terapêutica desejada durante o tempo requerido. Deste modo, a quantidade de agente terapêutico no alvo será apenas a necessária e os efeitos secundários serão mínimos. Por outro lado, os estudos das membranas biológicas e dos sistemas modelo de membrana têm demonstrado que a membrana celular não é uma mera barreira entre o meio extra e intracelular. Na verdade, as evidências apontam para uma grande complexidade das membranas celulares, tanto ao nível da sua compartimentação estrutural e funcional bem como no papel activo dos lípidos na manutenção do equilíbrio celular. É na junção destes dois contextos – membranas celulares e sistemas de entrega à escala nano/micrométrica – que o tópico das interacções entre estes dois sistemas se torna tão desafiante e de grande interesse biológico. Os estudos nesta área apontam que as características superficiais de nano/micro sistemas impactam significativamente as interacções entre estes dois sistemas. Características como tamanho, carga superficial, forma e hidrofobicidade de nano/micro sistemas parecem estar na base do mecanismo de interacção. Além do mais, alguns estudos apontam que aquando da interacção, estes nano e micro vectores podem interferir com a sinalização celular, induzir danos estruturais, alterar a expressão génica bem como modificar as características biofísicas das membranas celulares. No entanto, diversos estudos têm também demonstrado resultados contraditórios sobre quais dos factores primeiramente influenciam a interacção de nano/micro partículas. De facto, esta dependência pode também estar relacionada com o tipo de célula. Porém, o tópico das interacções ainda continua pouco estudado. A percepção clara dos factores que determinam o sucesso da interacção bem como do efeito imediato produzido na membrana celular irão permitir um desenho preciso destes sistemas de entrega de medicamentos. Além do mais, também irão possibilitar a modulação com melhor precisão do sucesso terapêutico e diminuir efeitos indesejáveis, como toxicidade. Assim, o objectivo deste projecto é desenvolver micropartículas (MPs) poliméricas modificadas à superfície para o estudo das interacções com sistema de modelo membranares. O poli(ácido láctico-co-glicólico) (PLGA) foi usado como matriz polimérica das MPs. Estas foram formuladas usando o método modificado de dupla emulsão por evaporação do solvente. A superfície destas MPs foi modificada usando ácido polivinílico (PVA), quitosano (CH) e alginato (ALG), para que se obtivessem partículas com carga superficial neutra, positiva e negativa, respetivamente. A composição e processo de produção das MPs foram optimizados de forma a obter características físico-químicas desejadas, nomeadamente span (medida da dispersão das populações) menor que 1. Posteriormente, as MPs foram marcadas com a sonda fluorescente cumarina-6. Esta sonda foi encapsulada na matriz polimérica usando cinco concentrações de cumarina-6: 0.01, 0.10, 0.20, 0.40 e 1.00 μg/mg (μg/mg expressa a concentração de coumarina-6/polímero). Assim, as PLGA MPs não fluorescentes e fluorescentes foram caracterizadas tendo em conta o seu tamanho, carga superficial, forma, eficiência de encapsulação, capacidade de carga e características espectrais através de Difracção Laser, Dispersão Electroforética da Luz, Espectroscopia de Absorção e Microscopia Confocal (respectivamente). De forma estudar a estabilidade e localização da sonda na matriz, foram preparadas cinco concentrações de MPs em suspensão: 0.10, 0.20, 0.25, 0.40, and 0.50 mg/mL. O estudo espectral, através de Espectroscopia de Fluorescência, permitiu também a optimização das condições experimentais (em termos de concentração de cumarina-6 e de concentração de MPs em suspensão) da última etapa do projecto. Para o efeito, foram adquiridos espectros de emissão/excitação e os valores de anisotropia de fluorescência em estado estacionário foram medidos. Posteriormente, Vesículas Gigantes Unilamelares (GUVs) contendo diferentes composições lipídicas e propriedades biofísicas foram preparadas por electroformação e marcadas com rodamina. Assim, foram preparadas GUVs homogeneamente fluídas (POPC), GUVs com separação de fases gel-fluído (POPC/DPPC 1:1 mol/mol) e separação de fases líquido ordenado–líquido desordenado (POPC/SM/Chol 1:1:1 mol/mol/mol). Finalmente, para o estudo das interacções recorreu-se a microscopia confocal. Os resultados demonstraram que as PLGA MPs não fluorescentes e fluorescentes têm diâmetros médios D50% entre 1.4±0.3 e 3.8±0.2 µm. A presença da cumarina-6 não produziu diferenças estatisticamente significativas, excepto para PLGA ALG MPs carregadas com 0.4 and 1.0 μg/ml de cumarin-6 (p < 0.01). Os valores de span variaram entre 1.1±0.2 e 4.8±1.1, o que demonstra heterogeneidade. Os resultados de carga superficial (medida pelo valor de ZP) variaram significativamente com a modificação à superfície (p < 0.001). Tanto para MPs fluorescentes como para não fluorescentes, a carga superficial situou-se nos intervalos de [(-17.8±0.9)-(-19.9±0.2)] mV, [50.8±2.7-58.7±3.4] mV e [(-30.8±2.3)- (-36.8±4.4)] mV para MPs modificadas com PVA, CH e ALG, respectivamente. A introdução da sonda não produziu alterações significativas nos valores de ZP. A caracterização morfológica revelou que as MPs são esféricas, podendo adoptar, nalguns casos, forma de foice (indicador de instabilidade). A caracterização espectral de cumarina-6 demonstrou que os comprimentos de onda de excitação/emissão máximos (ex max e em max) não variam significativamente com a concentração de suspensão de MPs e com o surfactante usado na formulação. Do mesmo modo, à medida que a concentração de MPs na suspensão aumenta, a intensidade máxima de fluorescência (F.I.) aumenta de maneira aproximadamente linear. Estes resultados demonstram que a sonda está essencialmente localizada na matriz polimérica e, deste modo, a sua partição entre o ambiente polimérico hidrofóbico e o ambiente hidrofílico que a rodeia, não é alterada. No entanto, com o aumento da concentração de cumarina-6 observou-se, no espectro de emissão da sonda, um ligeiro desvio de 15 nm para o vermelho. Os resultados das medidas de anisotropia mostram que para concentrações de sonda abaixo de 0.2 µm/mg, os valores são de aproximadamente 0.35, decrescendo para valores de 0.15, quando a concentração de sonda aumenta de 0.2 µm/mg para 1.00 µm/mg. A alteração dos valores de anisotropia e de desvio no espectro de emissão observado sugerem que, para altas concentrações, houve um aumento de moléculas não encapsuladas localizadas na superfície das MPs ou até mesmo na água. Tendo em conta o estudo espectral, a combinação de concentração de sonda/concentração de suspensão escolhida foi de [0.2 μg/mg; 0.25 mg/ml], pois representaram os valores medianos e os parâmetros analisados variarem linearmente. Além do mais, nessa concentração as imagens microscópicas adquiridas não teriam demasiada fluorescência. Os sistemas de modelo membranares, GUVs, foram preparados com sucesso. As GUVs compostas por POPC apresentaram uma distribuição homogénea de Rodamina-DOPE (1,2-Dioleoil-sn-glicero-3-fosfaetanolamina-N-(lissamina rodamina B Sulfonil), demonstrando a sua fluidez. Por outro lado, as vesículas compostas de POPC/DPPC (1:1 mol/mol) apresentaram separação de fases gel-fluído. A mistura ternária POPC/SM/Chol (1:1:1 mol/mol/mol) mostrou separação de fases fluído-fluído. No entanto, nalgumas POPC/SM/Chol (1:1:1 mol/mol/mol) GUVs, também se verificou a separação de fases gel-fluído. Finalmente, os estudos das interacções demonstraram nenhuma aproximação às vesículas homogeneamente fluidas. As observações feitas demonstraram que apenas as PLGA MPs marcadas com sonda com carga superficial altamente positivas e negativas interagiram com as GUVs compostas por POPC/DPPC (1:1 mol/mol), na fase gel e interface das fases gel-fluído. Resultados semelhantes foram obtidos com a mistura de POPC/SM/Chol, na qual as PLGA MPs modificadas com CH direccionaram-se para a fase líquida-ordenada. Os resultados descritos mostram que o tipo de surfactante usado produz uma clara distinção de carga superficial. A sonda cumarina-6 demonstrou ser adequada para marcação deste tipo de MPs pois a sua encapsulação permitiu a produção de um sistema sonda/MPs estável. Os estudos de interacção revelaram que a carga superficial das MPs e fase biofísica das GUVs determinam as interacções entre estes sistemas.
Os avanços feitos na área do transporte de agentes terapêuticos têm-se focado no desenvolvimento de sistemas à escala nano/micrométrica. Uma das vantagens desses sistemas promissores prende-se com a sua específicidade e eficiência na entrega do agente terapêutico à célula, tecido ou órgão alvo, permitindo a manutenção da concentração terapêutica desejada durante o tempo requerido. Deste modo, a quantidade de agente terapêutico no alvo será apenas a necessária e os efeitos secundários serão mínimos. Por outro lado, os estudos das membranas biológicas e dos sistemas modelo de membrana têm demonstrado que a membrana celular não é uma mera barreira entre o meio extra e intracelular. Na verdade, as evidências apontam para uma grande complexidade das membranas celulares, tanto ao nível da sua compartimentação estrutural e funcional bem como no papel activo dos lípidos na manutenção do equilíbrio celular. É na junção destes dois contextos – membranas celulares e sistemas de entrega à escala nano/micrométrica – que o tópico das interacções entre estes dois sistemas se torna tão desafiante e de grande interesse biológico. Os estudos nesta área apontam que as características superficiais de nano/micro sistemas impactam significativamente as interacções entre estes dois sistemas. Características como tamanho, carga superficial, forma e hidrofobicidade de nano/micro sistemas parecem estar na base do mecanismo de interacção. Além do mais, alguns estudos apontam que aquando da interacção, estes nano e micro vectores podem interferir com a sinalização celular, induzir danos estruturais, alterar a expressão génica bem como modificar as características biofísicas das membranas celulares. No entanto, diversos estudos têm também demonstrado resultados contraditórios sobre quais dos factores primeiramente influenciam a interacção de nano/micro partículas. De facto, esta dependência pode também estar relacionada com o tipo de célula. Porém, o tópico das interacções ainda continua pouco estudado. A percepção clara dos factores que determinam o sucesso da interacção bem como do efeito imediato produzido na membrana celular irão permitir um desenho preciso destes sistemas de entrega de medicamentos. Além do mais, também irão possibilitar a modulação com melhor precisão do sucesso terapêutico e diminuir efeitos indesejáveis, como toxicidade. Assim, o objectivo deste projecto é desenvolver micropartículas (MPs) poliméricas modificadas à superfície para o estudo das interacções com sistema de modelo membranares. O poli(ácido láctico-co-glicólico) (PLGA) foi usado como matriz polimérica das MPs. Estas foram formuladas usando o método modificado de dupla emulsão por evaporação do solvente. A superfície destas MPs foi modificada usando ácido polivinílico (PVA), quitosano (CH) e alginato (ALG), para que se obtivessem partículas com carga superficial neutra, positiva e negativa, respetivamente. A composição e processo de produção das MPs foram optimizados de forma a obter características físico-químicas desejadas, nomeadamente span (medida da dispersão das populações) menor que 1. Posteriormente, as MPs foram marcadas com a sonda fluorescente cumarina-6. Esta sonda foi encapsulada na matriz polimérica usando cinco concentrações de cumarina-6: 0.01, 0.10, 0.20, 0.40 e 1.00 μg/mg (μg/mg expressa a concentração de coumarina-6/polímero). Assim, as PLGA MPs não fluorescentes e fluorescentes foram caracterizadas tendo em conta o seu tamanho, carga superficial, forma, eficiência de encapsulação, capacidade de carga e características espectrais através de Difracção Laser, Dispersão Electroforética da Luz, Espectroscopia de Absorção e Microscopia Confocal (respectivamente). De forma estudar a estabilidade e localização da sonda na matriz, foram preparadas cinco concentrações de MPs em suspensão: 0.10, 0.20, 0.25, 0.40, and 0.50 mg/mL. O estudo espectral, através de Espectroscopia de Fluorescência, permitiu também a optimização das condições experimentais (em termos de concentração de cumarina-6 e de concentração de MPs em suspensão) da última etapa do projecto. Para o efeito, foram adquiridos espectros de emissão/excitação e os valores de anisotropia de fluorescência em estado estacionário foram medidos. Posteriormente, Vesículas Gigantes Unilamelares (GUVs) contendo diferentes composições lipídicas e propriedades biofísicas foram preparadas por electroformação e marcadas com rodamina. Assim, foram preparadas GUVs homogeneamente fluídas (POPC), GUVs com separação de fases gel-fluído (POPC/DPPC 1:1 mol/mol) e separação de fases líquido ordenado–líquido desordenado (POPC/SM/Chol 1:1:1 mol/mol/mol). Finalmente, para o estudo das interacções recorreu-se a microscopia confocal. Os resultados demonstraram que as PLGA MPs não fluorescentes e fluorescentes têm diâmetros médios D50% entre 1.4±0.3 e 3.8±0.2 µm. A presença da cumarina-6 não produziu diferenças estatisticamente significativas, excepto para PLGA ALG MPs carregadas com 0.4 and 1.0 μg/ml de cumarin-6 (p < 0.01). Os valores de span variaram entre 1.1±0.2 e 4.8±1.1, o que demonstra heterogeneidade. Os resultados de carga superficial (medida pelo valor de ZP) variaram significativamente com a modificação à superfície (p < 0.001). Tanto para MPs fluorescentes como para não fluorescentes, a carga superficial situou-se nos intervalos de [(-17.8±0.9)-(-19.9±0.2)] mV, [50.8±2.7-58.7±3.4] mV e [(-30.8±2.3)- (-36.8±4.4)] mV para MPs modificadas com PVA, CH e ALG, respectivamente. A introdução da sonda não produziu alterações significativas nos valores de ZP. A caracterização morfológica revelou que as MPs são esféricas, podendo adoptar, nalguns casos, forma de foice (indicador de instabilidade). A caracterização espectral de cumarina-6 demonstrou que os comprimentos de onda de excitação/emissão máximos (ex max e em max) não variam significativamente com a concentração de suspensão de MPs e com o surfactante usado na formulação. Do mesmo modo, à medida que a concentração de MPs na suspensão aumenta, a intensidade máxima de fluorescência (F.I.) aumenta de maneira aproximadamente linear. Estes resultados demonstram que a sonda está essencialmente localizada na matriz polimérica e, deste modo, a sua partição entre o ambiente polimérico hidrofóbico e o ambiente hidrofílico que a rodeia, não é alterada. No entanto, com o aumento da concentração de cumarina-6 observou-se, no espectro de emissão da sonda, um ligeiro desvio de 15 nm para o vermelho. Os resultados das medidas de anisotropia mostram que para concentrações de sonda abaixo de 0.2 µm/mg, os valores são de aproximadamente 0.35, decrescendo para valores de 0.15, quando a concentração de sonda aumenta de 0.2 µm/mg para 1.00 µm/mg. A alteração dos valores de anisotropia e de desvio no espectro de emissão observado sugerem que, para altas concentrações, houve um aumento de moléculas não encapsuladas localizadas na superfície das MPs ou até mesmo na água. Tendo em conta o estudo espectral, a combinação de concentração de sonda/concentração de suspensão escolhida foi de [0.2 μg/mg; 0.25 mg/ml], pois representaram os valores medianos e os parâmetros analisados variarem linearmente. Além do mais, nessa concentração as imagens microscópicas adquiridas não teriam demasiada fluorescência. Os sistemas de modelo membranares, GUVs, foram preparados com sucesso. As GUVs compostas por POPC apresentaram uma distribuição homogénea de Rodamina-DOPE (1,2-Dioleoil-sn-glicero-3-fosfaetanolamina-N-(lissamina rodamina B Sulfonil), demonstrando a sua fluidez. Por outro lado, as vesículas compostas de POPC/DPPC (1:1 mol/mol) apresentaram separação de fases gel-fluído. A mistura ternária POPC/SM/Chol (1:1:1 mol/mol/mol) mostrou separação de fases fluído-fluído. No entanto, nalgumas POPC/SM/Chol (1:1:1 mol/mol/mol) GUVs, também se verificou a separação de fases gel-fluído. Finalmente, os estudos das interacções demonstraram nenhuma aproximação às vesículas homogeneamente fluidas. As observações feitas demonstraram que apenas as PLGA MPs marcadas com sonda com carga superficial altamente positivas e negativas interagiram com as GUVs compostas por POPC/DPPC (1:1 mol/mol), na fase gel e interface das fases gel-fluído. Resultados semelhantes foram obtidos com a mistura de POPC/SM/Chol, na qual as PLGA MPs modificadas com CH direccionaram-se para a fase líquida-ordenada. Os resultados descritos mostram que o tipo de surfactante usado produz uma clara distinção de carga superficial. A sonda cumarina-6 demonstrou ser adequada para marcação deste tipo de MPs pois a sua encapsulação permitiu a produção de um sistema sonda/MPs estável. Os estudos de interacção revelaram que a carga superficial das MPs e fase biofísica das GUVs determinam as interacções entre estes sistemas.
Descrição
Tese de mestrado integrado, Engenharia Biomédica e Biofísica (Engenharia Clínica e Instrumentação Médica)Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2016
Palavras-chave
Micropartículas ácido poli(láctico-co-glicólico) Cumarina-6 Carga superficial Vesículas unilamelares gigantes Interacções Teses de mestrado - 2016