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Expression and function of the transcriptor factor PROX1 during the development of the gastrointestinal tract
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The gastrointestinal tract (gut) is a complex organ whose major functions are nutrient and water absorption. Its functioning relies on the coordinated work of many different tissue types such as smooth muscles innervated by the enteric nervous system (ENS), which allow the motility of food intake, while the intestine’s epithelium and the lymphatic system (LS) play a key role in nutrient absorption. Thus gut development through embryogenesis requires precise fine-tuning for the establishment and differentiation of all its components. Interestingly, LS and ENS, two components of the gut that will form networks, do not develop intrinsically but rather colonize the immature gut from adjacent tissues. The LS develops from venous endothelial cells inside the cardinal vein that migrate towards VEGFC gradient coming from the mesenchyme. The ENS arises from two distinct populations of neural crest cells (NCC): vagal and sacral. The vagal cells migrate in an antero-posterior direction, giving rise to most of the cells composing the ENS, while the sacral cells migrate inversely, colonizing the post-umbilical part of the intestines. In this study we found that although these two systems migrate towards the gut from very different locations and at different stages of development, they are both characterized by the expression of PROX1, codifying a transcriptor factor with a homeodomain capable of regulating the transcription of other genes. At initial stages (around E5) PROX1 is expressed in the nerve of Remak (NoR), a structure formed from sacral NCC. Interestingly, colonization of the intestines by this population of cells correlates with PROX1 downregulation, around E7-8. At later stages (E14) PROX1 expression is turned on again between the circular and longitudinal muscles, this time labeling the LS. Once specified the LS, PROX1 expression is always maintained. Between E15 and E18, the LS develops towards the epithelium. Further studies with in ovo and in vitro electroporation technique will be done in order to misexpress PROX1 in the NoR and address its function during ENS development.
O sistema gastrointestinal é um órgão vital, complexo e conservado entre os vertebrados. O seu desenvolvimento embrionário inicia-se no estádio HH8 com o aparecimento de uma invaginação na zona anterior do embrião. Em HH13, a segunda invaginação dá-se na zona posterior e estas duas alongam-se até à zona do embrião que se encontra ao nível do saco vitelino. Este tubo primitivo endodérmico é entretanto rodeado por mesoderme e estas duas camadas vão-se desenvolvendo, regionalizando-se em tubo digestivo anterior, médio e posterior. Após todos os processos de diferenciação estarem concluídos, o sistema gastrointestinal divide-se em faringe, esófago e estômago (tubo digestivo anterior), intestino delgado (tubo digestivo médio) e intestino grosso (tubo digestivo posterior). No modelo ave, algumas diferenças existem anatomicamente relativamente ao modelo mamífero: o papo substitui o esófago e as duas partes que constituem o estômago: fundus e antrum correspondem ao proventriculus e moela. O fundus é conhecido como a parte glandular do estômago e o antrum como a parte muscular. Em termos de citodiferenciação, o intestino é composto pela mucosa, submucosa, camadas musculares e serosa. Entre o músculo circular liso e longitudinal situa-se o plexus Auerbach ou mientérico; um segundo plexus existe também na camada submucosa, denominado de Meissner. Ao longo do sistema gastrointestinal, três grandes vasculaturas desenvolvem-se: sistema cardiovascular, linfático e entérico nervoso. Estas em conjunto com as células do músculo liso permitem que o sistema gastrointestinal cumpra as suas funções de digestão dos alimentos com a respectiva absorpção de nutrientes e água. O sistema linfático composto por veias, nódulos linfáticos e órgãos linfóides, tem funções ao nível da absorção, mas também na proteção contra agentes invasores e regulação da homeostasia. Embora seja um sistema de alta importância para o trato digestivo, este ainda se encontra por estudar, sendo apenas compreendido ao nível do seu primeiro surgimento na veia cardinal (E9 no modelo ratinho). A sua proximidade com o sistema cardiovascular advém de algumas células localizadas dorso-lateralmente na veia cardinal começarem a expressar Sox18 que, por sua vez, activa Prox1. Uma vez expresso o factor de transcrição Prox1, estas células já estão especificadas como endoteliais linfáticas, sendo sempre necessária a sua expressão para que a sua identidade se mantenha. Ao longo do eixo antero-posterior da veia, os conjuntos de células que expressam Prox1 vão aumentando o número de células a expressarem este gene e iniciam a sua migração em relação a um gradiente químico de VEGFC. O gradiente VEGFC é expresso pela mesoderme lateral e a indução da migração acontece por via de activação e dimerização dos receptores VEGFR3. Embora este receptor seja comum ao sistema circulatório cardiovascular, aquando do momento de migração das células endoteliais linfáticas este receptor não é expresso pelas células endoteliais sanguíneas. Essa migração leva à constituição de sacos linfáticos, que se expandem e fundem com outros sacos linfáticos, formando toda a rede linfática do corpo. A separação entre sistema cardiovascular e linfático acontece por via da expressão do gene Podoplanina, codificando uma proteína transmembranar do tipo das mucinas, que promove a agregação de plaquetas sanguíneas na zona de comunicação entre os dois sistemas. Este mecanismo é conhecido como o mecanismo de desenvolvimento geral do sistema linfático e embora seja responsável pela formação de toda a vasculatura linfática, o modo como ele atinge e se desenvolve nos órgãos está ainda por se determinar. Um outro sistema também importante para a fisiologia do sistema digestivo é o sistema entérico nervoso. Este sistema é responsável pelo movimento das células musculares lisas, facilitando os movimentos gastrointestinais e fluxo sanguíneo. O seu desenvolvimento dá-se a partir de células da crista neural de duas origens diferentes: vagal e sacral. Estas células encontram-se respectivamente no tubo neural entre os sómitos 1 e 7, e a partir do sómito 28º. Entre o limite do tubo neural e da ectoderme não neural, encontram-se estas células vagais e sacrais que sofrem uma transição epitélio-mesênquima, delaminam do epitélio e migram para o sistema gastrointestinal. Em galinha, as células sacrais formam uma estrutura externa ao cólon, mas próxima deste, denominada nervo de Remak. A sua extensão é desde o cólon até à parte pós-umbilical e ao contrário das células vagais, elas migram primeiro em direção ao plexus mientérico e somente depois para a submucosa. Esta migração do nervo para o cólon ocorre aproximadamente a E7.5, seguindo-se depois na direcção caudo-rostralmente. O sistema entérico nervoso é maioritariamente derivado das células vagais, mas as sacrais ainda contribuem 17% para a inervação do cólon. Diferentes vias de sinalização regulam a migração destas células no eixo anteroposterior, sendo as duas mais importantes as vias RET/GFRα1/GDNF e EDNRB/EDN3. Na via RET/GFRα1/GDNF, o ligando GDNF é expresso no mesênquima do estômago e cecum em diferentes estádios temporais, mas sempre numa posição anterior à frente das células vagais em migração. Este ligando promove a sobrevivência e proliferação dos precursores do sistema entérico nervoso e pensase que seja a principal via que regula a migração das células vagais, uma vez que estas expressam o receptor GFRα1. Contudo, na zona do cólon não existe nenhum ponto em que haja expressão significativa de GDNF, o que pode significar que outro mecanismo actue na regulação da migração dos precursores do sistema entérico nervoso nesta zona do sistema digestivo. A via EDNRB/EDN3 influencia a migração das células precursoras do sistema entérico nervoso. Em ratinho, o ligando Edn3 é expresso inicialmente nas células mesenquimatosas do tubo digestivo anterior e médio, mas mais tarde restringe-se ao cecum e cólon proximal. O receptor EdnrB é, por sua vez, fortemente expresso pelas células da crista neural em migração. Antagonistas deste receptor levam a problemas na migração destas células. Apesar do sistema linfático e entérico nervoso migrarem de regiões diferentes e em estádios embrionários distintos, neste projecto mostrou-se que são regulados pelo mesmo factor de transcrição PROX1. Em estádios precoces (E5), PROX1 é coexpresso com SOX10 no nervo de Remak. Por volta de E7.5-E8, a expressão de PROX1 diminui e desaparece, mantendo-se a expressão de SOX10 nas células sacrais da crista neural. Esta diminuição é observada tanto ao nível do mRNA como da proteína, sendo que nos estudos de imunohistoquímica o desaparecimento da expressão de PROX1 coincide com a entrada das células sacrais no cólon. Uma vez que PROX1 é expresso unicamente pelas células sacrais e não vagais, PROX1 torna-se no primeiro marcador encontrado que é diferencialmente expresso pelas duas populações de células do sistema entérico nervoso. Diferentes técnicas foram realizadas: ablação mecânica e química, in vivo e in vitro das células sacrais, e todas comprovaram a expressão de PROX1 por estas células. Mais tarde (E14), PROX1 surge entre as camadas de músculo liso circular e longitudinal do cólon, desta vez especificando o sistema linfático. Entre E15 e E18, as células endoteliais linfáticas migram das camadas musculares até à submucosa. Os resultados deste projecto mostram uma regulação temporal de PROX1 no desenvolvimento dos sistemas entérico nervoso e linfático. Tendo em conta a observação de uma expressão diferencial pelas células da crista neural sacral e vagal, os próximos estudos focar-se-ão na função da expressão de PROX1 pelas células sacrais. Os estudos de desregulação génica de PROX1 irão recorrer às ténicas de microinjecção e electroporação e terão como objectivo testar se PROX1 inibe a entrada das células sacrais no cólon.
O sistema gastrointestinal é um órgão vital, complexo e conservado entre os vertebrados. O seu desenvolvimento embrionário inicia-se no estádio HH8 com o aparecimento de uma invaginação na zona anterior do embrião. Em HH13, a segunda invaginação dá-se na zona posterior e estas duas alongam-se até à zona do embrião que se encontra ao nível do saco vitelino. Este tubo primitivo endodérmico é entretanto rodeado por mesoderme e estas duas camadas vão-se desenvolvendo, regionalizando-se em tubo digestivo anterior, médio e posterior. Após todos os processos de diferenciação estarem concluídos, o sistema gastrointestinal divide-se em faringe, esófago e estômago (tubo digestivo anterior), intestino delgado (tubo digestivo médio) e intestino grosso (tubo digestivo posterior). No modelo ave, algumas diferenças existem anatomicamente relativamente ao modelo mamífero: o papo substitui o esófago e as duas partes que constituem o estômago: fundus e antrum correspondem ao proventriculus e moela. O fundus é conhecido como a parte glandular do estômago e o antrum como a parte muscular. Em termos de citodiferenciação, o intestino é composto pela mucosa, submucosa, camadas musculares e serosa. Entre o músculo circular liso e longitudinal situa-se o plexus Auerbach ou mientérico; um segundo plexus existe também na camada submucosa, denominado de Meissner. Ao longo do sistema gastrointestinal, três grandes vasculaturas desenvolvem-se: sistema cardiovascular, linfático e entérico nervoso. Estas em conjunto com as células do músculo liso permitem que o sistema gastrointestinal cumpra as suas funções de digestão dos alimentos com a respectiva absorpção de nutrientes e água. O sistema linfático composto por veias, nódulos linfáticos e órgãos linfóides, tem funções ao nível da absorção, mas também na proteção contra agentes invasores e regulação da homeostasia. Embora seja um sistema de alta importância para o trato digestivo, este ainda se encontra por estudar, sendo apenas compreendido ao nível do seu primeiro surgimento na veia cardinal (E9 no modelo ratinho). A sua proximidade com o sistema cardiovascular advém de algumas células localizadas dorso-lateralmente na veia cardinal começarem a expressar Sox18 que, por sua vez, activa Prox1. Uma vez expresso o factor de transcrição Prox1, estas células já estão especificadas como endoteliais linfáticas, sendo sempre necessária a sua expressão para que a sua identidade se mantenha. Ao longo do eixo antero-posterior da veia, os conjuntos de células que expressam Prox1 vão aumentando o número de células a expressarem este gene e iniciam a sua migração em relação a um gradiente químico de VEGFC. O gradiente VEGFC é expresso pela mesoderme lateral e a indução da migração acontece por via de activação e dimerização dos receptores VEGFR3. Embora este receptor seja comum ao sistema circulatório cardiovascular, aquando do momento de migração das células endoteliais linfáticas este receptor não é expresso pelas células endoteliais sanguíneas. Essa migração leva à constituição de sacos linfáticos, que se expandem e fundem com outros sacos linfáticos, formando toda a rede linfática do corpo. A separação entre sistema cardiovascular e linfático acontece por via da expressão do gene Podoplanina, codificando uma proteína transmembranar do tipo das mucinas, que promove a agregação de plaquetas sanguíneas na zona de comunicação entre os dois sistemas. Este mecanismo é conhecido como o mecanismo de desenvolvimento geral do sistema linfático e embora seja responsável pela formação de toda a vasculatura linfática, o modo como ele atinge e se desenvolve nos órgãos está ainda por se determinar. Um outro sistema também importante para a fisiologia do sistema digestivo é o sistema entérico nervoso. Este sistema é responsável pelo movimento das células musculares lisas, facilitando os movimentos gastrointestinais e fluxo sanguíneo. O seu desenvolvimento dá-se a partir de células da crista neural de duas origens diferentes: vagal e sacral. Estas células encontram-se respectivamente no tubo neural entre os sómitos 1 e 7, e a partir do sómito 28º. Entre o limite do tubo neural e da ectoderme não neural, encontram-se estas células vagais e sacrais que sofrem uma transição epitélio-mesênquima, delaminam do epitélio e migram para o sistema gastrointestinal. Em galinha, as células sacrais formam uma estrutura externa ao cólon, mas próxima deste, denominada nervo de Remak. A sua extensão é desde o cólon até à parte pós-umbilical e ao contrário das células vagais, elas migram primeiro em direção ao plexus mientérico e somente depois para a submucosa. Esta migração do nervo para o cólon ocorre aproximadamente a E7.5, seguindo-se depois na direcção caudo-rostralmente. O sistema entérico nervoso é maioritariamente derivado das células vagais, mas as sacrais ainda contribuem 17% para a inervação do cólon. Diferentes vias de sinalização regulam a migração destas células no eixo anteroposterior, sendo as duas mais importantes as vias RET/GFRα1/GDNF e EDNRB/EDN3. Na via RET/GFRα1/GDNF, o ligando GDNF é expresso no mesênquima do estômago e cecum em diferentes estádios temporais, mas sempre numa posição anterior à frente das células vagais em migração. Este ligando promove a sobrevivência e proliferação dos precursores do sistema entérico nervoso e pensase que seja a principal via que regula a migração das células vagais, uma vez que estas expressam o receptor GFRα1. Contudo, na zona do cólon não existe nenhum ponto em que haja expressão significativa de GDNF, o que pode significar que outro mecanismo actue na regulação da migração dos precursores do sistema entérico nervoso nesta zona do sistema digestivo. A via EDNRB/EDN3 influencia a migração das células precursoras do sistema entérico nervoso. Em ratinho, o ligando Edn3 é expresso inicialmente nas células mesenquimatosas do tubo digestivo anterior e médio, mas mais tarde restringe-se ao cecum e cólon proximal. O receptor EdnrB é, por sua vez, fortemente expresso pelas células da crista neural em migração. Antagonistas deste receptor levam a problemas na migração destas células. Apesar do sistema linfático e entérico nervoso migrarem de regiões diferentes e em estádios embrionários distintos, neste projecto mostrou-se que são regulados pelo mesmo factor de transcrição PROX1. Em estádios precoces (E5), PROX1 é coexpresso com SOX10 no nervo de Remak. Por volta de E7.5-E8, a expressão de PROX1 diminui e desaparece, mantendo-se a expressão de SOX10 nas células sacrais da crista neural. Esta diminuição é observada tanto ao nível do mRNA como da proteína, sendo que nos estudos de imunohistoquímica o desaparecimento da expressão de PROX1 coincide com a entrada das células sacrais no cólon. Uma vez que PROX1 é expresso unicamente pelas células sacrais e não vagais, PROX1 torna-se no primeiro marcador encontrado que é diferencialmente expresso pelas duas populações de células do sistema entérico nervoso. Diferentes técnicas foram realizadas: ablação mecânica e química, in vivo e in vitro das células sacrais, e todas comprovaram a expressão de PROX1 por estas células. Mais tarde (E14), PROX1 surge entre as camadas de músculo liso circular e longitudinal do cólon, desta vez especificando o sistema linfático. Entre E15 e E18, as células endoteliais linfáticas migram das camadas musculares até à submucosa. Os resultados deste projecto mostram uma regulação temporal de PROX1 no desenvolvimento dos sistemas entérico nervoso e linfático. Tendo em conta a observação de uma expressão diferencial pelas células da crista neural sacral e vagal, os próximos estudos focar-se-ão na função da expressão de PROX1 pelas células sacrais. Os estudos de desregulação génica de PROX1 irão recorrer às ténicas de microinjecção e electroporação e terão como objectivo testar se PROX1 inibe a entrada das células sacrais no cólon.
Descrição
Tese de mestrado. Biologia (Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2014
Palavras-chave
Biologia do desenvolvimento Sistema gastrointestinal Teses de mestrado - 2014