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Publicação
The role of OsRMC gene in the JA signaling pathway: a transgenic approach in Arabidopsis and by Y1H assay
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Orientador(es)
Resumo(s)
Jasmonic acid is a plant hormone that has been involved in several biological processes such as development, biotic and abiotic stress. Previously, it was found in the host lab that a rice RNA interference (RNAi) – OsHOS1 line had up-regulation of OsRMC gene expression. In rice, this gene seems to be involved in the modulation of abiotic stress and root curling, acting as a negative regulator of the jasmonic acid signaling. OsRMC does not have a known homologue in Arabidopsis which makes this model species an important system to study the function of this gene. To achieve this goal, we overexpressed OsRMC in Arabidopsis in two different systems either in a cell suspension cultures (to study gene expression changes of JA-responsive genes) or whole plants (phenotypic changes induced by JA). We were able to obtain stable transgenic cell suspension culture overexpressing OsRMC as well for the empty vector (negative control). However, we were not able to see gene expression changes induced by JA even in untransformed cell suspension cultures for the analyzed genes (PDF1.2, VSP1 and MYC2). Regarding the transformation of whole plants, we generated three independent lines overexpressing OsRMC. These lines were characterized for transgene expression level and corresponding protein (OsRMC-RFP). We also performed a direct yeast one hybrid (Y1H) assay to complement the work done with Arabidopsis plants and cell suspension cultures regarding JA-signaling. In this assay, the promoter sequences of three genes involved in JA-signaling from rice (JAZ-like 1, JAZ-like 2 and JAZ-like 3) were analyzed. Promoter fragments corresponding to 1000bp upstream of the ATG codon of each gene were used as bait sequences. As prey, we used two transcription factors from the EREBP subfamily, previously identified as binding to the OsRMC gene promoter. However, we couldn’t detect interaction between the two TFs analyzed and the bait sequences from the JAZ genes. As future work, these baits strains will be screened by Y1H with cDNA libraries induced by salt or JA. As main achievements of this work, we were able to produce transgenic Arabidopsis plants overexpressing OsRMC which were fully characterized at transgene expression and protein level. These lines will be used in further studies such as to monitor expression changes in JA-responsive genes, determination of the sub-cellular localization of the OsRMC-RFP, and JA-induced phenotypic characterization.
O ácido jasmónico é uma hormona vegetal que está envolvida em vários processos biológicos tais como vias de desenvolvimento, stress biótico e abiótico. Foi descoberto anteriormente no laboratório anfitrião que uma linha de arroz de RNA de interferência (RNAi) – OsHOS1 apresentava uma expressão génica do gene OsRMC aumentada. Em arroz, este gene parece estar envolvido na modulação do stress abiótico e do encaracolamento das raizes, agindo como um regulador negativo da via de sinalização do ácido jasmónico. O gene OsRMC não tem nenhum homólogo conhecido em Arabidopsis, tornando esta espécie modelo num sistema importante para estudar a função deste gene. De modo a alcançar o objectivo principal, nós sobrexpressamos OsRMC em Arabidopsis em dois sistemas diferentes, quer em cultures de células em suspensão (para o estudo das alterações da expressão génica de genes que respondem ao ácido jasmónico) quer em plantas (alterações fenotípicas induzidas por ácido jasmónico) Fomos capazes de obter culturas estáveis transformadas de células em suspensão sobrexpressando OsRMC e também culturas transformadas com o vector vazio (controlo negativo). Contudo, não fomos capazes de vizualisar quaisquer alterações de expressão génica (para os genes analisados PDF1.2, VSP e MYC2) induzidas por ácido jasmónico mesmo em culturas de células em suspensão não transformadas. Em relação à transformação de plantas, foram geradas três linhas independentes sobreexpressando OsRMC. Estas linhas foram caracterizadas em termos de nível de expressão do transgene e da proteína correspondente (OsRMC-RFP) Neste trabalho também se inclui um ensaio directo de yeast one hybrid (Y1H) de modo a complementar o trabalho realizado com as plantas de Arabidopsis e as culturas de células em suspensão, no que diz respeito à sinalização pelo ácido jasmónico. Neste ensaio, as sequências dos promotores de três genes de arroz envolvidos na sinalização pelo ácido jasmónico (JAZ-like1, JAZ-like2 e JAZ-like3) from analizadas. Fragmentos dos promotores, correspondendo a 1000bp a montante do codão ATG de cada gene, foram usados como sequências “isca”. Como “presas”, usamos dois factores de transcrição da subfamilia EREBP, previamente reportados com capacidade de se ligarem ao promotor do gene OsRMC. Contudo, não conseguimos detectar qualquer interacção entre os dois TFs analisados e as sequências “isca” dos genes JAZ. Como trabalho futuro, estas estirpes criadas irão ser examinadas por Y1H com bibliotecas de cDNA induzidas por sal ou ácido jasmónico. Este trabalho tem como principais realizações a produção de plantas transgénicas de Arabidopsis sobrexpressando o gene OsRMC, as quais foram caracterizadas nos níveis de expressão do transgene e da proteína. Estas linhas serão usadas em estudos futuros de modo a monitorizar alterações de expressão de genes que respondem ao ácido jasmónico, na determinação da localização sub-celular da proteína OsRMC-RFP e na caracterização fenotípica induzida por ácido jasmónico.
O ácido jasmónico é uma hormona vegetal que está envolvida em vários processos biológicos tais como vias de desenvolvimento, stress biótico e abiótico. Foi descoberto anteriormente no laboratório anfitrião que uma linha de arroz de RNA de interferência (RNAi) – OsHOS1 apresentava uma expressão génica do gene OsRMC aumentada. Em arroz, este gene parece estar envolvido na modulação do stress abiótico e do encaracolamento das raizes, agindo como um regulador negativo da via de sinalização do ácido jasmónico. O gene OsRMC não tem nenhum homólogo conhecido em Arabidopsis, tornando esta espécie modelo num sistema importante para estudar a função deste gene. De modo a alcançar o objectivo principal, nós sobrexpressamos OsRMC em Arabidopsis em dois sistemas diferentes, quer em cultures de células em suspensão (para o estudo das alterações da expressão génica de genes que respondem ao ácido jasmónico) quer em plantas (alterações fenotípicas induzidas por ácido jasmónico) Fomos capazes de obter culturas estáveis transformadas de células em suspensão sobrexpressando OsRMC e também culturas transformadas com o vector vazio (controlo negativo). Contudo, não fomos capazes de vizualisar quaisquer alterações de expressão génica (para os genes analisados PDF1.2, VSP e MYC2) induzidas por ácido jasmónico mesmo em culturas de células em suspensão não transformadas. Em relação à transformação de plantas, foram geradas três linhas independentes sobreexpressando OsRMC. Estas linhas foram caracterizadas em termos de nível de expressão do transgene e da proteína correspondente (OsRMC-RFP) Neste trabalho também se inclui um ensaio directo de yeast one hybrid (Y1H) de modo a complementar o trabalho realizado com as plantas de Arabidopsis e as culturas de células em suspensão, no que diz respeito à sinalização pelo ácido jasmónico. Neste ensaio, as sequências dos promotores de três genes de arroz envolvidos na sinalização pelo ácido jasmónico (JAZ-like1, JAZ-like2 e JAZ-like3) from analizadas. Fragmentos dos promotores, correspondendo a 1000bp a montante do codão ATG de cada gene, foram usados como sequências “isca”. Como “presas”, usamos dois factores de transcrição da subfamilia EREBP, previamente reportados com capacidade de se ligarem ao promotor do gene OsRMC. Contudo, não conseguimos detectar qualquer interacção entre os dois TFs analisados e as sequências “isca” dos genes JAZ. Como trabalho futuro, estas estirpes criadas irão ser examinadas por Y1H com bibliotecas de cDNA induzidas por sal ou ácido jasmónico. Este trabalho tem como principais realizações a produção de plantas transgénicas de Arabidopsis sobrexpressando o gene OsRMC, as quais foram caracterizadas nos níveis de expressão do transgene e da proteína. Estas linhas serão usadas em estudos futuros de modo a monitorizar alterações de expressão de genes que respondem ao ácido jasmónico, na determinação da localização sub-celular da proteína OsRMC-RFP e na caracterização fenotípica induzida por ácido jasmónico.
Descrição
Tese de mestrado. Biologia (Biologia Celular e Biotecnologia). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2012
Palavras-chave
Biologia molecular Expressão génica Stress Arroz Transgénicos Teses de mestrado - 2012