Publicação
A large scale analysis of the dynamic cell behaviours that underlie the growth of the zebrafish porterior body
| dc.contributor.advisor | Hirsinger, Estelle | |
| dc.contributor.advisor | Thorsteinsdóttir, Sólveig, 1962- | |
| dc.contributor.author | Duarte, Fernando António Vinagre, 1990- | |
| dc.date.accessioned | 2014-11-21T18:11:50Z | |
| dc.date.available | 2014-11-21T18:11:50Z | |
| dc.date.issued | 2014 | |
| dc.description | Tese de mestrado. Biologia (Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2014 | por |
| dc.description.abstract | As vertebrate embryos develop, their posterior axis undergoes marked changes in size and tissue architecture. The morphogenetic behaviours underlying the formation of the posterior trunk and tail are complex. As of today, two models for posterior body formation have been proposed: the blastema and the “continuity of gastrulation” model. These two models can be rationalised into two canonical morphogenetic processes: the blastema model proposing that posterior body elongation is driven by anisotropic growth, whereas the continuation of gastrulation model postulates it is driven by tissue deformations. To address the relative contribution of these two mechanisms on posterior body elongation, we captured confocal stacks of fixed zebrafish embryos at different developmental stages, labelled with nuclear and membrane markers and performed surface reconstructions of all the posterior segments to measure their dimensions. Our morphogenetic analysis revealed not only that tailbud outgrowth undergoes at least two distinct phases, the first dominated by tissue deformation, the second by growth, but also that the majority of growth seems to occur in the anterior segments. Furthermore, we developed retrospective clonal analysis, a genetic single-cell labelling technique, in the zebrafish embryo, to investigate the identity and growth modes of the posterior axis precursors. With this method, we found no evidence of the existence of a stem cell pool resident in the zebrafish tailbud, which lead us to believe that posterior body formation in this model must be driven mainly by proliferation/dispersion of lineage-restricted progenitors. This observation was supported by the results we obtained while monitoring cell cycle progression in tailbud cells in Cecyil fish, a zebrafish transgenic line harbouring a set of cell cycle markers coupled with different fluorescent molecules, where we could not detect persistent proliferation in the tailbud. | por |
| dc.description.abstract | As vertebrate embryos develop, their posterior axis undergoes marked changes in size and tissue architecture. The morphogenetic behaviours underlying the formation of the posterior trunk and tail are complex. As of today, two models for posterior body formation have been proposed: the blastema and the “continuity of gastrulation” model. These two models can be rationalised into two canonical morphogenetic processes: the blastema model proposing that posterior body elongation is driven by anisotropic growth, whereas the continuation of gastrulation model postulates it is driven by tissue deformations. To address the relative contribution of these two mechanisms on posterior body elongation, we captured confocal stacks of fixed zebrafish embryos at different developmental stages, labelled with nuclear and membrane markers and performed surface reconstructions of all the posterior segments to measure their dimensions. Our morphogenetic analysis revealed not only that tailbud outgrowth undergoes at least two distinct phases, the first dominated by tissue deformation, the second by growth, but also that the majority of growth seems to occur in the anterior segments. Furthermore, we developed retrospective clonal analysis, a genetic single-cell labelling technique, in the zebrafish embryo, to investigate the identity and growth modes of the posterior axis precursors. With this method, we found no evidence of the existence of a stem cell pool resident in the zebrafish tailbud, which lead us to believe that posterior body formation in this model must be driven mainly by proliferation/dispersion of lineage-restricted progenitors. This observation was supported by the results we obtained while monitoring cell cycle progression in tailbud cells in Cecyil fish, a zebrafish transgenic line harbouring a set of cell cycle markers coupled with different fluorescent molecules, where we could not detect persistent proliferation in the tailbud. posterior do corpo resulta apenas da continuação dos processos iniciados durante a gastrulação, que incluem uma série de movimentos celulares. Tendo em conta ambos os modelos, é possível imaginar que o alongamento da região posterior do corpo pode ser explicado através de crescimento anisotrópico (proposto pelo modelo do blastema de Holmdahl), de deformações no tecido (proposto pelo modelo de continuação da gastrulação de Pasteels), ou pela combinação de ambos. Avanços recentes nas ferramentas disponíveis para realizar estudos de imaging, como por exemplo a utilização de técnicas modernas de microscopia confocal para realizar vídeos em tempo real, possibilitam a aquisição de datasets contínuos durante um longo período de tempo, permitindo a análise de comportamentos e movimentos morfogenéticos a nível celular. Juntamente com o aparecimento de software de análise de imagem mais poderoso, neste momento temos acesso a uma panóplia de métodos de alta resolução que nos permitem analisar o crescimento do embrião. Neste sentido, uma espécie opticamente transparente que possua desenvolvimento externo, e que portanto é facilmente acessível para qualquer tipo de manipulação, como é o caso do embrião de peixe-zebra, é especialmente indicada para este tipo de estudos. Por este motivo, seleccionámos o peixe-zebra como organismo modelo para utilizar neste estudo. Com o objectivo de analisar os comportamentos e movimentos morfogenéticos que ocorrem ao nível do tecido dos segmentos posteriores do embrião de peixe-zebra, e assim determinar a contribuição relativa dos dois mecanismos de crescimento do botão caudal referidos anteriormente, realizámos uma série de experiências, incluindo análises morfométricas, análise clonal retrospectiva e monitorização em tempo real do ciclo celular de células progenitoras residentes no botão caudal. Desta forma, no presente estudo pretendemos analisar: (1) as dimensões (comprimento, largura e altura) e o volume dos segmentos posteriores de embriões de peixe-zebra entre os estadios de 10 sómitos (14 hpf) e 32 sómitos (25,4 hpf), recorrendo à utilização do software Imaris; (2) as divisões celulares que ocorrem no botão caudal através da monitorização em tempo real do desenvolvimento da região posterior em embriões de peixe-zebra transgénicos da linha Cecyil, que possuem uma série de marcadores do ciclo celular acoplados a moléculas fluorescentes que permitem acompanhar a progressão do ciclo celular em células progenitoras residentes no botão causal; (3) as características (dimensões, frequência, identidade, distribuição e modo de crescimento) dos nichos de células progenitoras residentes ao nível do botão caudal, a partir dos clones gerados através da técnica de análise clonal retrospectiva, que se baseia na marcação aleatória e hereditária de células individuais, permitindo a análise clonal dos seus descendentes a longo prazo (Petit et al., 2005). A nossa análise morfométrica permitiu-nos identificar duas fases distintas envolvidas no processo de alongamento da região posterior do corpo no peixe-zebra. A primeira fase (em embriões com 14 a 21 hpf, ou seja, de 14 a 24 somitos) caracteriza-se por um aumento relativamente lento do comprimento e volume do embrião acompanhado por uma diminuição na largura e aumento na altura, sugerindo que o crescimento anisotrópico e apenas moderado e que a principal causa por detrás do alongamento provem de deformações do tecido, ao passo que a segunda fase (em embriões a partir de 21 hpf) é caracterizada por um aumento rápido do comprimento e do volume acompanhado pela estabilização da largura e altura dos segmentos, o que indica a ocorrência de apenas pequenas alterações na forma do tecido em conjunto com um crescimento anisotrópico acentuado. De um modo geral, estes resultados sugerem um cenário onde diferentes processos se encontram em jogo em alturas específicas e críticas do desenvolvimento para promoverem o alongamento do botão caudal. Tendo em conta estes resultados, e de forma a determinar quais os segmentos posteriores onde crescimento anisotrópico de facto ocorre, decidimos analisar variações no volume ao longo do tempo em todos os segmentos posteriores do embrião, a partir dos sómitos 13-14 até ao botão caudal, em embriões do estádio de 10 (14 hpf) até ao estadio de 30 somitos (24,4 hpf). Esta análise permitiu-nos concluir que crescimento anisotrópico mais acentuado ocorre maioritariamente nos segmentos que se encontram mais distanciados do botão caudal e que correspondem aos sómitos que se formam em primeiro lugar no embrião em todos os estadios de desenvolvimento. Após monitorização cuidadosa dos embriões durante alongamento do botão caudal, dois processos biológicos destacaram-se como bons candidatos hipotéticos para explicar esta resposta por parte do tecido, sendo eles o processo de dilatação das células da notocorda e a miogénese, mais especificamente o alongamento de miofibrilhas ao longo dos sómitos. Por este motivo, decidimos determinar em cada estadio do desenvolvimento qual o ultimo segmento posterior onde estes dois processos são observáveis, e comparar estas observações com as variações de volume observadas anteriormente em todos os segmentos posteriores. Por fim, propusemo-nos a analisar quais os modos de crescimento (baseado em proliferação/dispersão vs. nicho de células progenitoras estaminais) em jogo durante o alongamento do botão caudal. Como ponto de partida, os nossos resultados utilizando a linha Cecyil de peixe-zebra demonstraram que não existem praticamente células em proliferação activa no botão caudal, ou seja, na fase S do ciclo celular, o que sugere que o botão caudal não possui um nicho de células progenitoras estaminais. Estes resultados foram ainda corroborados pela nossa análise clonal retrospectiva, uma vez que que ao analisármos a biblioteca de clones obtida não conseguimos identificar nenhum clone multipotente que poderia sugerir a existência de um nicho de células estaminais residente no botão caudal. Apesar do nosso estudo ter já providenciado pistas em relação aos mecanismos e modos de crescimento envolvidos no processo de alongamento do botão caudal em peixe-zebra, futuramente seria importante realizar mais estudos focados na análise dos mecanismos celulares e moleculares responsáveis pela regulação deste processo, tais como: (1) analisar os comportamentos celulares por detrás das alterações observadas ao nível do tecido em relação à forma e tamanho dos segmentos; (2) investigar o papel que tanto a dilatação das células da notocorda como o alongamento das miofibrilhas ao longo dos sómitos desempenham durante o alongamento da região posterior do corpo de um modo mais detalhado; (3) confirmar a importância do papel da proliferação celular durante este processo, bem como a (não)existância de um nicho de células estaminais residentes no botão caudal em peixe-zebra; (4) realizar estudos complementares em diferentes organismos, incluindo amniotas e anamniotas, como por exemplo o anfioxo, de forma a efectuar estudos comparativos com o objectivo de estudar a conservação, ou não, dos mecanismos evolutivos por detrás do alongamento do botão caudal. | por |
| dc.identifier.tid | 201365642 | pt_PT |
| dc.identifier.uri | http://hdl.handle.net/10451/15323 | |
| dc.language.iso | eng | por |
| dc.subject | Biologia do desenvolvimento | por |
| dc.subject | Embriologia animal | por |
| dc.subject | Peixe-zebra | por |
| dc.subject | Proliferação de células | por |
| dc.subject | Teses de mestrado - 2014 | por |
| dc.title | A large scale analysis of the dynamic cell behaviours that underlie the growth of the zebrafish porterior body | por |
| dc.type | master thesis | |
| dspace.entity.type | Publication | |
| rcaap.rights | openAccess | por |
| rcaap.type | masterThesis | por |
| thesis.degree.level | Mestre | por |
| thesis.degree.name | Mestrado em Biologia | por |