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Publicação
Dealing with copper toxicity: new insights into copper detoxification in yeast
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Orientador(es)
Resumo(s)
Copper, an essential metal, is a double-edged sword, as its vital nature is counterbalanced by the toxic effect that it can exert on cells when not properly controlled. As such, organisms have evolved defence mechanisms against copper toxicity and, in the yeast Saccharomyces cerevisiae, the transcription factor Ace1 orchestrates several of those mechanisms, by activating copper-detoxification genes. In Saccharomyces cerevisiae iron uptake is partially dependent on copper, as the membrane multicopper-oxidase Fet3, which is part of the high-affinity iron uptake system, requires copper as a cofactor. Aft1, the low iron-sensing transcription factor in yeast, is known to regulate the expression of FET3 gene. However, we found that a strain lacking FET3 is more sensitive to copper surplus conditions than a strain carrying the AFT1 gene disrupted. This finding suggests that under such conditions another regulator came into play and controls FET3 gene expression. We next evaluated whether Ace1 could be the alternative regulator of FET3 under copper excess. To test this hypothesis, the expression of FET3 gene in cells lacking ACE1, AFT1 or both was monitored, using yeast-one hybrid and qRT-PCR approaches. A decrease of FET3 transcripts is observed, under copper loading, when ACE1 is deleted, suggesting that Ace1 is involved in FET3 regulation. Remarkably, in the absence of AFT1 we observed a copper-dependent induction of FET3 gene that was, however, completely abrogated when ACE1 was deleted from the aft1 mutant background. Our data clearly indicates that FET3 expression is dependent on Ace1 when copper is overly abundant. In this study, the link between iron and copper homeostasis was further established. Indeed, we found that ace1 cells display marked upregulation of Aft1’s targets, such as CTH2, and accumulate higher amounts of iron and copper, in a mechanism dependent on Aft1. Altogether, this work unveiled a novel protection mechanism against copper toxicity mediated by Ace1, which relies in the activations of FET3 and results in the restriction of Aft1 activity as to prevent excessive copper accumulation.
O cobre é um metal essencial para a vasta maioria dos organismos, maioritariamente devido às suas propriedades de oxidação-redução, que o tornam ideal para ser cofactor de inúmeras proteínas. Nos humanos, o cobre é essencial para inúmeras funções celulares, nomeadamente para o metabolismo energético, produção de melanina e catecolaminas, destoxificação de espécies reactivas de oxigénio e homeostase de ferro. No entanto, a sua natureza essencial é contrabalançada pelos efeitos tóxicos causados quando este metal está presente em níveis acima dos considerados fisiológicos. De facto, sabe-se que o excesso de cobre potencia a produção de espécies reactivas de oxigénio (ROS), através da reacção de Fenton, e que este metal pode mesmo danificar os centros metálicos de enzimas e proteínas, levando à perda de função. Assim, os organismos desenvolveram inúmeros mecanismos de defesa contra a toxicidade provocada pelo cobre. Na levedura Saccharomyces cerevisiae, o factor de transcrição Ace1 é o responsável pela regulação destes mecanismos, ao activar genes de destoxificação do cobre, tais como genes codificantes de metalotioneínas CUP1 e CRS5, que actuam como quelantes de iões de cobre, e o gene SOD1, que codifica o superóxido dismutase, enzima que além de conter cobre no seu centro activo, é essencial na resposta ao stress oxidativo causado por este metal. Em Saccharomyces cerevisiae a entrada de ferro (Fe) na célula é parcialmente dependente do cobre, uma vez que o Fet3, uma ferroxidase de membrana que faz parte do complexo de transporte de alta afinidade de ferro, requer cobre como cofactor. O Aft1, o principal factor de transcrição envolvido na resposta à deficiência de ferro em levedura, é o conhecido regulador da expressão do gene FET3. No entanto, diversos resultados apresentados neste trabalho demonstram claramente que uma estirpe sem o gene FET3 é mais sensível ao excesso de cobre do que uma estirpe mutada no gene AFT1. Esta evidência sugere que, em condições de excesso de cobre, um outro regulador controla a expressão do gene FET3. Deste modo, foi avaliada a possibilidade de o factor de transcrição Ace1 ser o regulador alternativo do gene FET3 em condições de excesso de cobre. De facto, a região promotora do gene FET3 contém uma possível sequência de ligação do Ace1, localizada a -578 bp a montante do codão de iniciação ATG (+1). Através da monitorização dos níveis de expressão do FET3 na estirpe-selvagem e na estirpe mutada no gene ACE1 (mutante ace1), foi possível concluir que o factor de transcrição Ace1 está envolvido na regulação do gene FET3. Foi ainda observado que mesmo na ausência do regulador Aft1, ocorre uma indução da expressão do FET3, dependente do cobre que, no entanto, é totalmente suprimida quando se elimina o geneACE1. Através da monitorização da expressão de um dos genes alvo do factor de transcrição Aft1, CTH2, na estirpe selvagem e na estirpe ace1, em condições de excesso de cobre, através da técnica de qRT-PCR, observou-se que, na ausência do Ace1, há um aumento drástico dos níveis dos transcritos de CTH2. Estes dados sugerem que, na estirpe mutante ace1, a homeostase de ferro encontra-se desregulada, pelo que ocorrerá uma super-activação do factor Aft1. De acordo com esta hipótese, foi observado que a estirpe ace1 contém níveis de ferro e de cobre intracelulares marcadamente elevados quando comparados com os da estirpe-selvagem. Esta acumulação é dependente da actividade do regulador Aft1, uma vez que a sua eliminação (na estirpe mutante aft1ace1) repõe os níveis dos dois metais para valores semelhantes aos da estirpe-selvagem. O Fet3 é um enzima importante para a resposta celular ao excesso de cobre. Foi descrito que a estirpe mutante fet3 acumula grandes quantidades de cobre. Neste estudo, observou-se que esta acumulação ocorre através de um mecanismo dependente do factor de transcrição Aft1, dado que o duplo mutante fet3aft1 reverte os níveis de cobre intracelulares para níveis semelhantes aos da estirpe selvagem. Através da análise dos genes alvo do Aft1, foram seleccionados possíveis proteínas envolvidas neste mecanismo. A deleção do genes FET4, que codifica um transportador de ferro de baixa afinidade, que também tem a capacidade de transportar cobre, e do ARN4, que codifica um transportador de sideróforos de ferro, cujo substrato é a enterobactina, levou a um ganho de resistência ao cobre quando deletados de uma estirpe fet3. Resultados semelhantes foram registados após a deleção do gene FRE1, que codifica uma metaloreductase de membrana, envolvida no transporte de ferro e cobre. Estes resultados evidenciaram que a acção combinada de várias proteínas envolvidas no transporte de ferro contribuem para a acumulação de cobre observada numa estirpe mutante fet3. Assim a deficiência de ferro observada na estirpe mutante fet3, conduzirá à activação do factor de transcrição Aft1 que induzirá a expressão dos genes dessas proteínas, numa tentativa de colmatar a falta de ferro consequente da perda do sistema de transporte de ferro de alta afinidade. Neste estudo, foi ainda possível observar que a estirpe mutante aft1, que apresenta um fenótipo de sensibilidade em condições normais crescimento, recupera o seu défice de crescimento quando cobre é adicionado ao meio de cultura. Contrariamente ao esperado, a atenuação observada não é devida a um aumento do conteúdo intracelular de ferro, quando as células são crescidas na presença de cobre, uma vez que os níveis de ferro da estirpe aft1 são inferiores aos níveis registados quando cultivada em condições normais de crescimento. Com o objectivo de compreender o mecanismo subjacente a este fenómeno, testaram-se outras vias dependentes de cobre poderiam estar afectadas em condições normais de crescimento no mutante aft1, nomeadamente a respiração mitocondrial, (dado que o cobre é um cofactor do citocromo c oxidase), e a resposta ao stress oxidativo (uma vez que o cobre faz parte do Cu,Zn-Superóxido dismutase). Através da análise da sensibilidade do mutante aft1 em meio YPDGE (meio de cultura rico, contendo quase exclusivamente fontes de carbono não fermentáveis), concluiu-se que a adição de cobre melhora a capacidade respiratória da estirpe aft1, dado que foi observado uma significativa recuperação da sensibilidade deste mutante. Além disso, a análise fenotípica do mutante aft1 cultivado em meio contendo paraquat (um composto gerador de anião superóxido), suplementado ou não com cobre, permite concluir que a adição de cobre alivia também a sensibilidade desta estirpe ao stress oxidativo provocado pelo paraquat. Assim, os resultados obtidos sugerem que numa estirpe aft1 a adição de cobre promove o metabolismo respiratório e fortalece a resposta ao stress oxidativo, contribuindo desta forma para o aliviar do défice de crescimento exibido por esta estirpe. Assim, no seu conjunto, os dados apresentados nesta dissertação permitem propor uma nova via de destoxificação de cobre mediada pelo factor de transcrição Ace1. Em condições de excesso de cobre, as células de levedura activam este regulador, que por sua vez irá induzir a expressão do gene FET3. Sendo uma proteína que contém cobre no seu centro activo, o enzima Fet3 contribui não só para o tamponamento dos iões de cobre livres presentes no citosol, como também para a entrada de ferro na célula. A entrada de ferro irá prevenir a activação excessiva do Aft1, e consequente expressão dos seus genes alvo, limitando assim a entrada de mais cobre através de transportadores de baixa afinidade para ferro, o que eventualmente, levaria à morte celular. Assim, neste estudo foi pela primeira vez demonstrado que além do seu papel essencial na destoxificação do cobre intracelular, o Ace1 possui também um papel fundamental na prevenção da entrada de cobre extracelular.
O cobre é um metal essencial para a vasta maioria dos organismos, maioritariamente devido às suas propriedades de oxidação-redução, que o tornam ideal para ser cofactor de inúmeras proteínas. Nos humanos, o cobre é essencial para inúmeras funções celulares, nomeadamente para o metabolismo energético, produção de melanina e catecolaminas, destoxificação de espécies reactivas de oxigénio e homeostase de ferro. No entanto, a sua natureza essencial é contrabalançada pelos efeitos tóxicos causados quando este metal está presente em níveis acima dos considerados fisiológicos. De facto, sabe-se que o excesso de cobre potencia a produção de espécies reactivas de oxigénio (ROS), através da reacção de Fenton, e que este metal pode mesmo danificar os centros metálicos de enzimas e proteínas, levando à perda de função. Assim, os organismos desenvolveram inúmeros mecanismos de defesa contra a toxicidade provocada pelo cobre. Na levedura Saccharomyces cerevisiae, o factor de transcrição Ace1 é o responsável pela regulação destes mecanismos, ao activar genes de destoxificação do cobre, tais como genes codificantes de metalotioneínas CUP1 e CRS5, que actuam como quelantes de iões de cobre, e o gene SOD1, que codifica o superóxido dismutase, enzima que além de conter cobre no seu centro activo, é essencial na resposta ao stress oxidativo causado por este metal. Em Saccharomyces cerevisiae a entrada de ferro (Fe) na célula é parcialmente dependente do cobre, uma vez que o Fet3, uma ferroxidase de membrana que faz parte do complexo de transporte de alta afinidade de ferro, requer cobre como cofactor. O Aft1, o principal factor de transcrição envolvido na resposta à deficiência de ferro em levedura, é o conhecido regulador da expressão do gene FET3. No entanto, diversos resultados apresentados neste trabalho demonstram claramente que uma estirpe sem o gene FET3 é mais sensível ao excesso de cobre do que uma estirpe mutada no gene AFT1. Esta evidência sugere que, em condições de excesso de cobre, um outro regulador controla a expressão do gene FET3. Deste modo, foi avaliada a possibilidade de o factor de transcrição Ace1 ser o regulador alternativo do gene FET3 em condições de excesso de cobre. De facto, a região promotora do gene FET3 contém uma possível sequência de ligação do Ace1, localizada a -578 bp a montante do codão de iniciação ATG (+1). Através da monitorização dos níveis de expressão do FET3 na estirpe-selvagem e na estirpe mutada no gene ACE1 (mutante ace1), foi possível concluir que o factor de transcrição Ace1 está envolvido na regulação do gene FET3. Foi ainda observado que mesmo na ausência do regulador Aft1, ocorre uma indução da expressão do FET3, dependente do cobre que, no entanto, é totalmente suprimida quando se elimina o geneACE1. Através da monitorização da expressão de um dos genes alvo do factor de transcrição Aft1, CTH2, na estirpe selvagem e na estirpe ace1, em condições de excesso de cobre, através da técnica de qRT-PCR, observou-se que, na ausência do Ace1, há um aumento drástico dos níveis dos transcritos de CTH2. Estes dados sugerem que, na estirpe mutante ace1, a homeostase de ferro encontra-se desregulada, pelo que ocorrerá uma super-activação do factor Aft1. De acordo com esta hipótese, foi observado que a estirpe ace1 contém níveis de ferro e de cobre intracelulares marcadamente elevados quando comparados com os da estirpe-selvagem. Esta acumulação é dependente da actividade do regulador Aft1, uma vez que a sua eliminação (na estirpe mutante aft1ace1) repõe os níveis dos dois metais para valores semelhantes aos da estirpe-selvagem. O Fet3 é um enzima importante para a resposta celular ao excesso de cobre. Foi descrito que a estirpe mutante fet3 acumula grandes quantidades de cobre. Neste estudo, observou-se que esta acumulação ocorre através de um mecanismo dependente do factor de transcrição Aft1, dado que o duplo mutante fet3aft1 reverte os níveis de cobre intracelulares para níveis semelhantes aos da estirpe selvagem. Através da análise dos genes alvo do Aft1, foram seleccionados possíveis proteínas envolvidas neste mecanismo. A deleção do genes FET4, que codifica um transportador de ferro de baixa afinidade, que também tem a capacidade de transportar cobre, e do ARN4, que codifica um transportador de sideróforos de ferro, cujo substrato é a enterobactina, levou a um ganho de resistência ao cobre quando deletados de uma estirpe fet3. Resultados semelhantes foram registados após a deleção do gene FRE1, que codifica uma metaloreductase de membrana, envolvida no transporte de ferro e cobre. Estes resultados evidenciaram que a acção combinada de várias proteínas envolvidas no transporte de ferro contribuem para a acumulação de cobre observada numa estirpe mutante fet3. Assim a deficiência de ferro observada na estirpe mutante fet3, conduzirá à activação do factor de transcrição Aft1 que induzirá a expressão dos genes dessas proteínas, numa tentativa de colmatar a falta de ferro consequente da perda do sistema de transporte de ferro de alta afinidade. Neste estudo, foi ainda possível observar que a estirpe mutante aft1, que apresenta um fenótipo de sensibilidade em condições normais crescimento, recupera o seu défice de crescimento quando cobre é adicionado ao meio de cultura. Contrariamente ao esperado, a atenuação observada não é devida a um aumento do conteúdo intracelular de ferro, quando as células são crescidas na presença de cobre, uma vez que os níveis de ferro da estirpe aft1 são inferiores aos níveis registados quando cultivada em condições normais de crescimento. Com o objectivo de compreender o mecanismo subjacente a este fenómeno, testaram-se outras vias dependentes de cobre poderiam estar afectadas em condições normais de crescimento no mutante aft1, nomeadamente a respiração mitocondrial, (dado que o cobre é um cofactor do citocromo c oxidase), e a resposta ao stress oxidativo (uma vez que o cobre faz parte do Cu,Zn-Superóxido dismutase). Através da análise da sensibilidade do mutante aft1 em meio YPDGE (meio de cultura rico, contendo quase exclusivamente fontes de carbono não fermentáveis), concluiu-se que a adição de cobre melhora a capacidade respiratória da estirpe aft1, dado que foi observado uma significativa recuperação da sensibilidade deste mutante. Além disso, a análise fenotípica do mutante aft1 cultivado em meio contendo paraquat (um composto gerador de anião superóxido), suplementado ou não com cobre, permite concluir que a adição de cobre alivia também a sensibilidade desta estirpe ao stress oxidativo provocado pelo paraquat. Assim, os resultados obtidos sugerem que numa estirpe aft1 a adição de cobre promove o metabolismo respiratório e fortalece a resposta ao stress oxidativo, contribuindo desta forma para o aliviar do défice de crescimento exibido por esta estirpe. Assim, no seu conjunto, os dados apresentados nesta dissertação permitem propor uma nova via de destoxificação de cobre mediada pelo factor de transcrição Ace1. Em condições de excesso de cobre, as células de levedura activam este regulador, que por sua vez irá induzir a expressão do gene FET3. Sendo uma proteína que contém cobre no seu centro activo, o enzima Fet3 contribui não só para o tamponamento dos iões de cobre livres presentes no citosol, como também para a entrada de ferro na célula. A entrada de ferro irá prevenir a activação excessiva do Aft1, e consequente expressão dos seus genes alvo, limitando assim a entrada de mais cobre através de transportadores de baixa afinidade para ferro, o que eventualmente, levaria à morte celular. Assim, neste estudo foi pela primeira vez demonstrado que além do seu papel essencial na destoxificação do cobre intracelular, o Ace1 possui também um papel fundamental na prevenção da entrada de cobre extracelular.
Descrição
Tese de mestrado, Bioquímica (Bioquímica), Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2016
Palavras-chave
Saccharomyces cerevisiae Cobre Acel Fet3 Destoxificação de cobre Teses de mestrado - 2016