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Publicação
Discovery of biomarkers for the efficacy of Adalimumab in ankylosing spondylitis patients using a metabolomic approach
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Autores
Orientador(es)
Resumo(s)
A Espondilite Anquilosante (EA) é uma doença reumática crónica e inflamatória que afecta
maioritariamente as articulações do esqueleto axial. A inflamação em EA afecta particularmente as
enteses (área onde os tendões se ligam ao osso) da articulação sacroilíaca e das vértebras da coluna.
Pacientes com EA sofrem, em geral, de dor dorsal, fadiga, e de uma crescente redução da mobilidade
vertebral. Adicionalmente uma percentagem significativa de pacientes com EA (de 30 a 50%) também
exibem manifestações periféricas como artrite ou dactilite (inflamação nos dedos, da mão ou pé) e uma
minoria pode ainda apresentar manifestações extra-articulares como uveíte, psoríase, ou doença
inflamatória intestinal (de 10 a 25%). A inflamação crónica em EA leva gradualmente a alterações
estruturais ao nível das vértebras. A alteração estrutural mais caraterística da EA é a formação de
sindesmófitos dentro do ligamento vertebral. Sindesmófitos são crescimentos ósseos formados nas
margens do disco intervertebral, que pode resultar na fusão de vertebras adjacentes (anquilose), processo
da qual a EA recebe o seu nome.
A patologia da EA é multifacetada, envolvendo interacções complexas entre uma predisposição
genética, disfunção do sistema imunitário, e desregulação da microbiota gastrointestinal. Entre os
factores genéticos, o mais influente é a presença do gene HLA-27 que representa dois-terços da
herdabilidade da doença. Aproximadamente 90% dos pacientes com EA possuem o gene HLA-B27, no
entanto, apenas 5% dos portadores do gene desenvolvem a doença, o que sugere o envolvimento de
factores genéticos e ambientais adicionais para a etiologia da EA. Ainda não é claro qual o papel
definitivo do HLA-B27 na patogénese da EA, tendo três hipóteses canónicas, não-exclusivas, e
conducentes a inflamação sido propostas: a hipótese da Cadeia Pesada Livre, a hipótese da proteína
Misfolded, e a hipótese do Péptido Artritogénico. A hipótese da Cadeia Pesada Livre baseia-se no facto
do heterodímero de HLA-B27 ter a tendência de se dissociar na superfície celular e formar homodímeros
de cadeia pesada. A hipótese da proteína Misfolded descreve a tendência que a HLA-B27 tem em formar
homodímeros de cadeia pesada intracelulares após ser sintetizado no Reticulo Endoplasmático. Isto leva
a uma estrutura tridimensional incorrecta (Misfolded) da proteína. A acumulação de HLA-B27
misfolded no citoplasma inicia uma resposta de stress celular. A hipótese do Péptido Artritogénico
propõe que um hospedeiro perca a tolerância imunitária para péptidos próprios específicos na sequência
da activação do sistema imunitário por um péptido de origem patogénica com uma sequência de
aminoácidos semelhante. Este processo é denominado mimetismo molecular. Vários estudos implicam
a bactéria Klebsiella pneumoniae como sendo a fonte desse péptido de origem patogénica.
Apesar da incerteza sobre a etiologia exacta da EA, actualmente, a hipótese predominante é que a EA
se tende a desenvolver em indivíduos com uma predisposição genética e uma microbiota intestinal
disbiótica. Disbiose intestinal pode ser definida como perturbações significativas na população
microbiana intestinal que são conducentes a doença. É estimado que 87% dos pacientes de EA tenham
uma microbiota intestinal desregulada, sendo esta uma característica quase intrínseca da doença. As
bactérias disbióticas de pacientes de EA estimulam a abertura do espaço intercelular das barreiras
intestinais epiteliais e vasculares. Este aumento de permeabilidade das barreiras intestinais permite a
translocação de micróbios e antigénios microbianos para os tecidos adjacentes, colocando-os em
contacto directo com as células do sistema imunitário da mucosa intestinal. Este contacto directo
desencadeia, em primeiro lugar, uma inflamação local ao nível do intestino. É estimado que até 70% de
pacientes com EA tenham inflamação intestinal subclínica e que 5 a 10% dos mesmos progridam para
manifestações de inflamação intestinal mais severas como a doença inflamatória intestinal. No entanto,
vários estudos sugerem que este contacto directo com antigénios activa os leucócitos dos tecidos
intestinais subepiteliais e que estes, de seguida, migram do intestino e da corrente sanguínea para as enteses e articulações onde desencadeiam e/ou perpetuam os processos inflamatórios sistémicos
associados com a EA.
Actualmente, com base na sua fisiopatologia, a EA pode ser vista como um espectro de doenças onde
coexistem, ou existem em momentos diferentes, mecanismos pertencentes tanto ao sistema imunitário
inato como ao adaptativo. Enquanto que em outros pacientes poderá haver, em alternativa, uma
predominância de um dos ramos do sistema imunitário sobre o outro. Esta confluência dos dois ramos
do sistema imunitário na EA pode contribuir para a variabilidade clínica ao nível dos sintomas e resposta
ao tratamento. Não obstante, numa maioria dos pacientes a patologia da EA é caracterizada por uma
excessiva e prolongada produção de TNF-α sendo, por isso, esta citocina um alvo primordial para terapia
com anticorpos monoclonais. Inibidores de TNF-α (TNFi) como o Adalimumab são o medicamento
biológico de primeira escolha para pacientes com EA. O Adalimumab é um anticorpo monoclonal
totalmente humano que neutraliza eficientemente o TNF-α solúvel e transmembranar. No entanto,
apenas 60% dos pacientes com EA são classificados como respondedores aos TNFi e esta constatação
pode demorar um a três anos a ser feita. Existe, portanto, uma necessidade urgente em antecipar o
tratamento mais adequado para cada paciente dado que vários estudo mostram que uma iniciação
precoce é crucial para uma substancial melhoria na qualidade de vida e no prognóstico da doença. A
metabolómica é uma ferramenta muito útil para este tipo de medicina personalizada. Esta abordagem
permite o estudo em larga escala dos metabolitos – moléculas com uma baixa massa molecular (<1-1.5
kDa) – presentes numa amostra biológica. Os nossos objectivos são portanto a identificação de
marcadores moleculares que permitam antecipar a resposta de pacientes de EA ao Adalimumab e avaliar
os efeitos sistémicos do mesmo.
Um grupo de 24 pacientes com EA foram tratados subcutaneamente com 40 mg de Adalimumab a cada
duas semanas. Foram colhidas amostras de sangue antes de administrar a primeira dose de Adalimumab
(TP1), 3-5 dias depois da primeira dose (TP2), na segunda semana (TP3), e no final do estudo na semana
14 (TP4). Os pacientes foram classificados como Respondedores (n=12) e Não-respondedores (n=12)
de acordo com a sua pontuação na avaliação do ASAS20 ao tempo 4. Os metabolitos foram extraídos
do soro sanguíneo e analisados por cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massa em tandem
(LC-MS/MS) utilizando polaridades positiva e negativa. Análises estatísticas uni e multivariadas foram
usadas para determinar quais os metabolitos cujos níveis variavam significativamente ao longo do tempo
e entre os dois grupos de doentes (respondedores vs não-respondedores). As vias metabólicas alteradas
ao longo do tratamento foram identificadas por “Pathway Analysis”.
A análise por LC-MS/MS permitiu a identificação e quantificação de 76 metabolitos serológicos no
modo de polaridade positivo e 57 no negativo. Isto resultou na identificação combinada de 122
metabolitos únicos. Foram realizadas análises estatísticas multivariadas entre Respondedores e NãoRespondedores para os mesmos pontos temporais (e.g., R-TP1 vs NR-TP1) e entre diferentes pontos
temporais dentro do mesmo grupo de pacientes (e.g., R-TP1 vs R-TP2). Não foram encontradas
diferenças significativas entre Respondedores e Não-Respondedores para os mesmos pontos temporais
tanto nas análises multivariadas como nas univariadas (teste t de Student). Isto foi verificado em ambos
os modos de ionização. Também não foram encontradas diferenças estatíticas dentro de cada grupo de
pacientes quando os quatro pontos temporais foram analisados em conjunto nem quando o TP1 foi
emparelhado com cada um dos restantes pontos temporais.
No entanto, através de uma análise multivariada, foi obtido um modelo discriminatório de PLS-DA
válido (Q2 = 0.477, R2 = 0.879, and p = 0.001 em 2000 permutações) apenas para os metabolitos
quantificados em modo positivo dos pacientes Respondedores quando o TP4 foi exluído. O modelo
identificou variações significativas nos níveis de 18 metabolitos, mas apenas entre o TP1 até ao TP3.
Análises por teste t de Student mostraram que não existem diferenças estatisticamente significativas nos níveis dos metabolitos entre o TP1 e o TP4. Logo, os pacientes no TP1 são estatisticamente
indistinguíveis dos pacientes do TP4 em relação ao metaboloma serológico quantificado. Este resultado
explica porque é que o modelo PLS-DA perde a sua capacidade discriminatória quando adicionamos o
TP4 à análise estatística. Nenhum modelo válido foi obtido para o grupo dos Não-respondedores. Por
Pathway Analysis foi revelado que o metabolismo da Fenilalanina (p = 0.0043) e do Triptofano (p =
0.0076) estão alterados de forma significativa nos pacientes Respondedores.
Do conjunto de 18 metabolitos dados como significativos para a capacidade discriminatória do modelo,
sete foram seleccionados para avaliar os impactos metabólicos sistémicos do Adalimumab. Estes
metabolitos foram seleccionados considerando um conjunto de factores, nomeadamente: o peso da sua
contribuição relativa para a capacidade discriminatória do modelo, pertencerem às vias metabólicas
alteradas, e a existência de literatura adequada. As variações longitudinais dos níveis dos metabolitos
seleccionados podem ser explicadas através de uma redução sistémica da inflamação causada pelo
Adalimumab, sendo que destes, quatro são explicadas especificamente com uma redução da inflamação
intestinal. Neste estudo não foi possível descriminar diretamente entre Respondedores e Nãorespondedores ao Adalimumab analisando o metaboloma serológico. No entanto, verificou-se que a
variação longitudinal do metaboloma serológico dos pacientes Respondedores está relacionada com uma
redução sistémica da inflamação, o que não ocorre no grupo de pacientes Não-respondedores.
Ankylosing Spondylitis (AS) is a chronic, inflammatory, rheumatic disease of unknown aetiology that mainly affects the axial joints. AS pathogenesis is characterised by an excessive and prolonged production of TNF-α, making it a prime target for monoclonal antibody (mAb) therapy. Adalimumab is a fully human mAb that neutralises soluble and transmembrane TNF-α. However, only 60% of AS patients respond favourably to Adalimumab therapy. Early adequate therapy is crucial for a better disease prognosis and quality of life. Metabolomics is a powerful tool in identifying biomarkers for therapeutic response. We therefore aim to identify metabolic biomarkers that can predict the response of AS patients to Adalimumab and reveal its systemic effects. AS patients were treated with Adalimumab and blood samples were collected before and during treatment. Patients were then classified as Responders or NonResponders. Using LC-MS/MS, 122 metabolites were quantified. It was not possible to distinguish by direct comparison the two patient groups using multivariate statistical analysis. However, within the Responders group, statistically valid variations occurred on the levels of 19 metabolites during treatment. A Pathway Analysis on those metabolites revealed the metabolism of phenylalanine and tryptophan to be altered significantly. Longitudinal variations in the levels of most metabolites were explained by an Adalimumab-driven reduction in intestinal inflammation. This supports, at a molecular level, the juxtaposition between TNFi responsiveness and intestinal inflammation observed by clinicians.
Ankylosing Spondylitis (AS) is a chronic, inflammatory, rheumatic disease of unknown aetiology that mainly affects the axial joints. AS pathogenesis is characterised by an excessive and prolonged production of TNF-α, making it a prime target for monoclonal antibody (mAb) therapy. Adalimumab is a fully human mAb that neutralises soluble and transmembrane TNF-α. However, only 60% of AS patients respond favourably to Adalimumab therapy. Early adequate therapy is crucial for a better disease prognosis and quality of life. Metabolomics is a powerful tool in identifying biomarkers for therapeutic response. We therefore aim to identify metabolic biomarkers that can predict the response of AS patients to Adalimumab and reveal its systemic effects. AS patients were treated with Adalimumab and blood samples were collected before and during treatment. Patients were then classified as Responders or NonResponders. Using LC-MS/MS, 122 metabolites were quantified. It was not possible to distinguish by direct comparison the two patient groups using multivariate statistical analysis. However, within the Responders group, statistically valid variations occurred on the levels of 19 metabolites during treatment. A Pathway Analysis on those metabolites revealed the metabolism of phenylalanine and tryptophan to be altered significantly. Longitudinal variations in the levels of most metabolites were explained by an Adalimumab-driven reduction in intestinal inflammation. This supports, at a molecular level, the juxtaposition between TNFi responsiveness and intestinal inflammation observed by clinicians.
Descrição
Tese de Mestrado, Biologia Molecular e Genética , 2024, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências
Palavras-chave
Espondilite Anquilosante Metabolómica Adalimumab Biomarcador Farmacometabolómica Teses de mestrado - 2024