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Publicação
Biochemical studies on clinical variants of Glutaryl-CoA Dehydrogenase, a mitochondrial enzyme involved in the rare disease Glutaric Aciduria type-I
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Resumo(s)
Glutaric Acidemia Type I (GA-I) is an autosomal recessive metabolic disorder caused by mutations on the GCDH gene, with an estimated incidence of 1: 100 000 newborns worldwide. The GCDH gene encodes for Glutaryl-CoA Dehydrogenase, a flavoprotein involved in tryptophan, lysine and hydroxylsine metabolism. The clinical aspects regarding GA-I have been the subject of intensive study, however studies concerning the effects of the mutations at the protein level are scarce. Besides, up until now a clear correlation between genotype and phenotype has not been found, constituting a gap in knowledge. Our project aims to clarify the molecular mechanism behind this disorder and also establish a possible correlation between genotype and phenotype. For this, we studied two missense mutations, GCDH-p.Arg227Pro and GCDH-p.Val400Met to discriminate their effects on folding, stability and function. These mutations were identified in two heterozygous patients, which had the Arg227Pro mutation in one allele and the Val400Met mutation in the other, and associated with high residual activity, which was not observed for homozygous patients, suggesting a case of interallelic complementation. We also studied a variant with the two mutations GCDH-p.Arg227Pro/-p.Val400Met as an approximation of heterozygosity. The results showed that the clinical variants retain the overall fold of the wild type protein, with no significant changes. The GCDH-p.Val400Met and the GCDH-p.Arg227Pro/-p.Val400Met variants led to decreased stability, while the GCDH-p.Arg227Pro increased GCDH’s stability. Moreover, all variants showed compromised enzymatic activity, GDCH-p.Val400Met variant has 70 % and the GCDH-p.Arg227Pro and GCDH-p.Arg227Pro/-p.Val400Met variants have 5 % of that of the wild-type protein. The results also showed that when mimicking a fever episode the GCDH-p.Val400Met variant loses the cofactor faster than the wild type protein, suggesting a weakened interaction with flavin. Because of that, we studied the effect of flavin addition to this variant, which resembles the treatment with riboflavin supplementation. When purified with flavin in the soluble extract this variant was present in two forms, Apo and Holo, therefore we studied the effect of flavin addition on both forms. Upon incubation with external flavin the Holo form of GCDH-p.Val400Met showed an increased conformational stability, and to a smaller extent this was also observed for the Apo form. Through a gel filtration analysis, we observed a shift in the elution volume of Apo GCDH-p.Val400Met upon incubation with flavin, suggesting a change in this protein’s conformation. Also when incubated with flavin Apo GCDH-p.Val400Met presented an enzymatic activity rescue to 46 % of that of the wild-type GCDH. We also tested how the addition of 2.5-fold excess flavin to Holo GCDH-p.Val400Met would affect its behaviour in a feverish situation. We observed that, with addition of flavin, this form of the variant maintained the initial enzymatic activity throughout the incubation period, indicating that riboflavin supplementation in patients with this mutation might be beneficial. Overall, the data gathered contributes for a better understanding of the molecular mechanism behind GA-I, as well as the interallelic complementation between the mutations studied. It also shows that knowing the consequences of the mutations at a molecular level, could help in the development of more targeted therapies.
Os erros inatos do metabolismo constituem um grupo de doenças genéticas que resultam de defeitos em proteínas envolvidas em vias metabólicas. A Acidúria Glutárica tipo I (GA-I) está incluída neste grupo e é uma doença metabólica autossómica recessiva causada por mutações no gene GCDH, tendo uma prevalência de 1:100 000 recém-nascidos em todo o mundo. Em Portugal, a prevalência é de 1: 76 045 recém-nascidos e o rastreio é feito através do “Teste do Pezinho”, sendo que a GA-I foi incluída neste rastreio em 2004. O gene GCDH codifica para a proteína Glutaril-CoA Desidrogenase, uma flavoproteína presente na matriz mitocondrial envolvida no metabolismo do triptofano, lisina e hidroxilisina. Os aspetos clínicos associados à GA-I encontram-se bem documentados e são o foco de inúmeros estudos, no entanto estudos sobre os efeitos das mutações a nível proteico são raros. Até aos dias de hoje foram identificadas mais de 200 mutações no gene da GCDH, sendo que a grande maioria leva a defeitos no folding proteico. Para além disso, até aos dias de hoje ainda não foi possível estabelecer uma correlação entre o genótipo e o fenótipo. O objetivo deste trabalho é compreender o mecanismo molecular da GA-I e estabelecer uma possível correlação genótipo-fenótipo. Foram estudados os efeitos de duas mutações, GCDH-p.Arg227Pro e GCDH-p.Val400Met, no folding proteico, estabilidade e atividade. Estas mutações foram identificadas em dois pacientes heterozigóticos, os quais apresentam a mutação Arg227Pro num alelo e a mutação Val400Met noutro, que tinham uma elevada atividade residual, cerca de 30 % quando comparado com valores normais. Pacientes homozigóticos com estas mutações apresentam valores mais baixos de atividade enzimática, 8 % e 10 % dos valores normais para GCDH-p.Arg227Pro e GCDH-p.Val400Met, respetivamente. Isto sugere um caso de complementação interalélica. Como aproximação ao caso dos pacientes heterozigóticos, também se estudou o efeito no folding proteico, estabilidade e atividade de uma variante com as duas mutações, GCDH-p.Arg227Pro/-p.Val400Met. Para se poder realizar os ensaios que irão ser descritos ao longo do trabalho, foi necessário expressar e purificar as diferentes variantes. Para tal, as diferentes proteínas recombinantes humanas foram expressas em E. coli, e posteriormente sujeitas a vários passos de purificação, até se obter um extrato solúvel. Este extrato foi então sujeito a uma cromatografia de afinidade com o intuito de se obter as frações puras de GCDH. Em primeiro lugar, fez-se uma análise in silico de modo a tentar perceber quais seriam os potenciais efeitos das mutações a nível da estrutura proteica. No caso da GCDH-p.Arg227Pro, a substituição de uma arginina para uma prolina pode levar ao aumento de rigidez na estrutura e também a uma possível quebra de uma interação eletrostática da arginina com um resíduo carregado negativamente. Através de modelos estruturais obtidos com o servidor WhatIF, foi possível perceber que nesta variante a substituição pode levar a alterações na estrutura secundária presente nas proximidades da mutação. No caso da GCDH-p.Val400Met, a substituição de uma valina para uma metionina pode não levar a grandes alterações a nível estrutural, uma vez que ambos os aminoácidos apresentam propriedades semelhantes. Com o modelo estrutural obtido para esta variante, também recorrendo ao servidor WhatIF, observou-se que a substituição pode levar a alterações na estrutura próxima da mutação. Após esta análise inicial, foram feitos estudos de folding proteico recorrendo a técnicas biofísicas, como o dicroísmo circular e a espetroscopia de fluorescência. Os resultados obtidos mostraram que no geral as variantes clínicas mantêm o folding proteico observado para a GCDH ‘wild type’ (WT). No entanto, observou-se menos conteúdo em estrutura secundária para todas as variantes e um desvio para o vermelho no espetro de emissão dos triptofanos para as variantes GCDH-p.Val400Met e GCDH-p.Arg227Pro/p.Val400Met, sugerindo uma estrutura menos compacta nestas últimas. Em termos de estabilidade conformacional, observou-se um decréscimo nas variantes GCDH-p.Val400Met e GCDH-p.Arg227Pro/p.Val400Met, e um aumento na variante GCDH-p.Arg227Pro. Mais precisamente, no caso da variante GCDH-p.Val400Met, observou-se um decréscimo da estabilidade térmica nas curvas de desnaturação obtidas por FRET, o que sugere uma interação mais fraca com a flavina. O aumento da estabilidade para a GCDH-p.Arg227Pro sugere que esta estrutura é mais rígida e menos flexível, o que pode ser causado pela substituição para uma prolina. Em relação à atividade enzimática, todas as variantes mostraram um decréscimo, a variante GCDH-p.Val400Met tem 70 % de atividade e as variantes GCDH-p.Arg227Pro e GCDH-p.Arg227Pro/-p.Val400Met têm 5 % de atividade quando comparado com a GCDH-WT, quando se usa PMS como aceitador de eletrões. Medindo a atividade enzimática utilizando o aceitador fisiológico da GCDH, ETF, obtêm-se atividades de 34 % e 2 % para as variantes GCDH-p.Val400Met e GCDH-p.Arg227Pro, respetivamente. Na doença GA-I, os sintomas neurológicos agudos são normalmente causados por episódios de febre ou infeção. Mimetizando um episódio de febre, as proteínas foram incubadas durante 1 hora a 39 °C e foi seguida a cinética de perda de flavina. Observou-se que a variante GCDH-p.Val400Met apresentava uma dissociação do cofator mais pronunciada, sugerindo que a interação entre a proteína e o cofator está comprometida. Um dos tratamentos utilizados na doença GA-I é a suplementação com riboflavina. Inúmeros estudos já demonstraram que a flavina funciona como um chaperão farmacológico, resgatando defeitos de folding e promovendo a estabilização proteica. Como uma das variantes estudadas neste trabalho apresenta uma fraca interação com o cofator, o segundo objetivo deste trabalho foi estudar o efeito da adição de flavina externa nessa mesma variante. Após a purificação da GCDH-p.Val400Met observou-se que existiam duas formas da proteína, uma Apo sem o cofator e uma Holo com o cofator incorporado. Através de uma análise por cromatografia de exclusão molecular, observou-se que após a adição de flavina à forma Apo da variante esta exibe um desvio no volume de eluição, sugerindo que a flavina leva a uma alteração conformacional desta proteína. Também se estudou o efeito da adição de flavina na estabilidade das duas formas da variante GCDH-p.Val400Met. Observou-se um efeito estabilizador significativo na forma Holo após incubação com 2.5 vezes mais de flavina, tanto na análise espectroscópica através de dicroísmo circular e fluorescência, assim como no ensaio de proteólise limitada. Na forma Apo apenas se observou um efeito a nível da estrutura secundária e no ensaio de digestão proteolítica, sendo que este efeito não foi tão pronunciado como o observado para a forma Holo. Também foi avaliado se a forma Apo da variante GCDH-p.Val400Met, após incubação com flavina, incorporava o cofator e se recuperava atividade enzimática. Observou-se por espetroscopia UV-Visível que após incubação com flavina, esta forma incorpora o cofator. Para além disso, observou-se que a forma Apo recuperava 46 % da atividade enzimática. Para perceber se a flavina tinha algum efeito na atividade enzimática da forma Holo da variante GCDH-p.Val400Met durante um episódio de febre, incubou-se a proteína nas mesmas condições referidas anteriormente, 1 hora a 39 °C. Observou-se que a presença de flavina levava à manutenção do valor inicial de atividade enzimática ao longo de todo o período de incubação. Estes resultados indicam que em pacientes homozigóticos para esta variante, GCDH-p.Val400Met, a suplementação com riboflavina pode ser benéfica em condições de stress, como por exemplo a febre. No geral, os resultados obtidos neste trabalho contribuem para a compreensão do mecanismo molecular da GA-I, assim como para a compreensão da complementação interalélica entre as variantes clínicas. O estudo do efeito das mutações a nível proteico ajuda a perceber o que leva à perda de função na proteína, por exemplo o folding proteico defeituoso ou interações fracas com o cofator. Desta forma, sabendo a consequência que uma determinada mutação tem a nível molecular, tal pode auxiliar no desenvolvimento de terapias-alvo para os pacientes.
Os erros inatos do metabolismo constituem um grupo de doenças genéticas que resultam de defeitos em proteínas envolvidas em vias metabólicas. A Acidúria Glutárica tipo I (GA-I) está incluída neste grupo e é uma doença metabólica autossómica recessiva causada por mutações no gene GCDH, tendo uma prevalência de 1:100 000 recém-nascidos em todo o mundo. Em Portugal, a prevalência é de 1: 76 045 recém-nascidos e o rastreio é feito através do “Teste do Pezinho”, sendo que a GA-I foi incluída neste rastreio em 2004. O gene GCDH codifica para a proteína Glutaril-CoA Desidrogenase, uma flavoproteína presente na matriz mitocondrial envolvida no metabolismo do triptofano, lisina e hidroxilisina. Os aspetos clínicos associados à GA-I encontram-se bem documentados e são o foco de inúmeros estudos, no entanto estudos sobre os efeitos das mutações a nível proteico são raros. Até aos dias de hoje foram identificadas mais de 200 mutações no gene da GCDH, sendo que a grande maioria leva a defeitos no folding proteico. Para além disso, até aos dias de hoje ainda não foi possível estabelecer uma correlação entre o genótipo e o fenótipo. O objetivo deste trabalho é compreender o mecanismo molecular da GA-I e estabelecer uma possível correlação genótipo-fenótipo. Foram estudados os efeitos de duas mutações, GCDH-p.Arg227Pro e GCDH-p.Val400Met, no folding proteico, estabilidade e atividade. Estas mutações foram identificadas em dois pacientes heterozigóticos, os quais apresentam a mutação Arg227Pro num alelo e a mutação Val400Met noutro, que tinham uma elevada atividade residual, cerca de 30 % quando comparado com valores normais. Pacientes homozigóticos com estas mutações apresentam valores mais baixos de atividade enzimática, 8 % e 10 % dos valores normais para GCDH-p.Arg227Pro e GCDH-p.Val400Met, respetivamente. Isto sugere um caso de complementação interalélica. Como aproximação ao caso dos pacientes heterozigóticos, também se estudou o efeito no folding proteico, estabilidade e atividade de uma variante com as duas mutações, GCDH-p.Arg227Pro/-p.Val400Met. Para se poder realizar os ensaios que irão ser descritos ao longo do trabalho, foi necessário expressar e purificar as diferentes variantes. Para tal, as diferentes proteínas recombinantes humanas foram expressas em E. coli, e posteriormente sujeitas a vários passos de purificação, até se obter um extrato solúvel. Este extrato foi então sujeito a uma cromatografia de afinidade com o intuito de se obter as frações puras de GCDH. Em primeiro lugar, fez-se uma análise in silico de modo a tentar perceber quais seriam os potenciais efeitos das mutações a nível da estrutura proteica. No caso da GCDH-p.Arg227Pro, a substituição de uma arginina para uma prolina pode levar ao aumento de rigidez na estrutura e também a uma possível quebra de uma interação eletrostática da arginina com um resíduo carregado negativamente. Através de modelos estruturais obtidos com o servidor WhatIF, foi possível perceber que nesta variante a substituição pode levar a alterações na estrutura secundária presente nas proximidades da mutação. No caso da GCDH-p.Val400Met, a substituição de uma valina para uma metionina pode não levar a grandes alterações a nível estrutural, uma vez que ambos os aminoácidos apresentam propriedades semelhantes. Com o modelo estrutural obtido para esta variante, também recorrendo ao servidor WhatIF, observou-se que a substituição pode levar a alterações na estrutura próxima da mutação. Após esta análise inicial, foram feitos estudos de folding proteico recorrendo a técnicas biofísicas, como o dicroísmo circular e a espetroscopia de fluorescência. Os resultados obtidos mostraram que no geral as variantes clínicas mantêm o folding proteico observado para a GCDH ‘wild type’ (WT). No entanto, observou-se menos conteúdo em estrutura secundária para todas as variantes e um desvio para o vermelho no espetro de emissão dos triptofanos para as variantes GCDH-p.Val400Met e GCDH-p.Arg227Pro/p.Val400Met, sugerindo uma estrutura menos compacta nestas últimas. Em termos de estabilidade conformacional, observou-se um decréscimo nas variantes GCDH-p.Val400Met e GCDH-p.Arg227Pro/p.Val400Met, e um aumento na variante GCDH-p.Arg227Pro. Mais precisamente, no caso da variante GCDH-p.Val400Met, observou-se um decréscimo da estabilidade térmica nas curvas de desnaturação obtidas por FRET, o que sugere uma interação mais fraca com a flavina. O aumento da estabilidade para a GCDH-p.Arg227Pro sugere que esta estrutura é mais rígida e menos flexível, o que pode ser causado pela substituição para uma prolina. Em relação à atividade enzimática, todas as variantes mostraram um decréscimo, a variante GCDH-p.Val400Met tem 70 % de atividade e as variantes GCDH-p.Arg227Pro e GCDH-p.Arg227Pro/-p.Val400Met têm 5 % de atividade quando comparado com a GCDH-WT, quando se usa PMS como aceitador de eletrões. Medindo a atividade enzimática utilizando o aceitador fisiológico da GCDH, ETF, obtêm-se atividades de 34 % e 2 % para as variantes GCDH-p.Val400Met e GCDH-p.Arg227Pro, respetivamente. Na doença GA-I, os sintomas neurológicos agudos são normalmente causados por episódios de febre ou infeção. Mimetizando um episódio de febre, as proteínas foram incubadas durante 1 hora a 39 °C e foi seguida a cinética de perda de flavina. Observou-se que a variante GCDH-p.Val400Met apresentava uma dissociação do cofator mais pronunciada, sugerindo que a interação entre a proteína e o cofator está comprometida. Um dos tratamentos utilizados na doença GA-I é a suplementação com riboflavina. Inúmeros estudos já demonstraram que a flavina funciona como um chaperão farmacológico, resgatando defeitos de folding e promovendo a estabilização proteica. Como uma das variantes estudadas neste trabalho apresenta uma fraca interação com o cofator, o segundo objetivo deste trabalho foi estudar o efeito da adição de flavina externa nessa mesma variante. Após a purificação da GCDH-p.Val400Met observou-se que existiam duas formas da proteína, uma Apo sem o cofator e uma Holo com o cofator incorporado. Através de uma análise por cromatografia de exclusão molecular, observou-se que após a adição de flavina à forma Apo da variante esta exibe um desvio no volume de eluição, sugerindo que a flavina leva a uma alteração conformacional desta proteína. Também se estudou o efeito da adição de flavina na estabilidade das duas formas da variante GCDH-p.Val400Met. Observou-se um efeito estabilizador significativo na forma Holo após incubação com 2.5 vezes mais de flavina, tanto na análise espectroscópica através de dicroísmo circular e fluorescência, assim como no ensaio de proteólise limitada. Na forma Apo apenas se observou um efeito a nível da estrutura secundária e no ensaio de digestão proteolítica, sendo que este efeito não foi tão pronunciado como o observado para a forma Holo. Também foi avaliado se a forma Apo da variante GCDH-p.Val400Met, após incubação com flavina, incorporava o cofator e se recuperava atividade enzimática. Observou-se por espetroscopia UV-Visível que após incubação com flavina, esta forma incorpora o cofator. Para além disso, observou-se que a forma Apo recuperava 46 % da atividade enzimática. Para perceber se a flavina tinha algum efeito na atividade enzimática da forma Holo da variante GCDH-p.Val400Met durante um episódio de febre, incubou-se a proteína nas mesmas condições referidas anteriormente, 1 hora a 39 °C. Observou-se que a presença de flavina levava à manutenção do valor inicial de atividade enzimática ao longo de todo o período de incubação. Estes resultados indicam que em pacientes homozigóticos para esta variante, GCDH-p.Val400Met, a suplementação com riboflavina pode ser benéfica em condições de stress, como por exemplo a febre. No geral, os resultados obtidos neste trabalho contribuem para a compreensão do mecanismo molecular da GA-I, assim como para a compreensão da complementação interalélica entre as variantes clínicas. O estudo do efeito das mutações a nível proteico ajuda a perceber o que leva à perda de função na proteína, por exemplo o folding proteico defeituoso ou interações fracas com o cofator. Desta forma, sabendo a consequência que uma determinada mutação tem a nível molecular, tal pode auxiliar no desenvolvimento de terapias-alvo para os pacientes.
Descrição
Tese de mestrado, Bioquímica (Bioquímica Médica) Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2018
Palavras-chave
Folding proteico GA-I GCDH Flavina Suplementação com riboflavina Teses de mestrado - 2018