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Publicação
Interactions between the cytoskeleton and the ionic fluxes in the regulation of cell polarity in pollen tubes
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Orientador(es)
Resumo(s)
Cell polarity reflects the combined action of complex mechanisms that establish and maintain functionally specialized domains in the plasma membrane and cytoplasm. Pollen tubes are one of the best models to study polarization events in plants, since the apical growth is accompanied by structural features, namely the cytoplasmic zonation and the polarized pattern of extracellular proton fluxes. The main goal of this project aimed at unravelling the cellular mechanisms involved in the regulation of extracellular proton (H+) fluxes in pollen tubes. The cytoskeleton plays an essential role in pollen tube polarized growth, in addition to represent a structural component of these cells. The hypothesis tested here was that this structure could participate in the regulation of the proton fluxes, as a consequence of its involvement in the control of the localization of protein that conveys proton extrusion from the cell, the H+ATPases. This choice was based on the recently characterized specific proton ATPase NHA from Nicotiana tabacum pollen tubes, by the group were this project was developed. The first approach consisted in the evaluation of alterations in the extracellular proton fluxes in response to actin cytoskeleton and microtubule disturbance, using a ion selective micro-vibrating probe. Nicotiana tabacum pollen tubes reveal three membrane domains: the apical domain, that present proton influxes; the posterior regions of the tube (beginning 30 m from the tip towards the grain) and the grain, that presents proton effluxes; and an area between the previous two (~20 m from the tip), that shows no net flux of protons. The proton ATPase NHA was visualized in pollen tubes transiently transformed with the Lat52::NHA::GFP construct. These proteins assume an uneven distribution in pollen tubes plasma membrane, revealing the tight connection with the proton fluxes measured. This protein is not detected at the tip. A gradient of accumulation is detected originated in the lateral apex until 20 µm behind the tip, were the accumulation is maximal, and plateaus until the basis of the tube. Actin cytoskeleton disturbance promoted the alteration of the proton flux pattern, as a consequent of the misplacement of the proton ATPases. Microtubule disturbance alone reveals no effect in the regulation of the extracellular proton fluxes. However the disturbance of microtubules together with the mild disturbance of actin, bellow the effective concentrations alone, affects proton flux pattern in pollen tubes. This brings new insights on the role played by microtubules in pollen tubes. Two possible mechanisms might act in a concerted manner. The actin cytoskeleton is known to be involved in membrane retrieval that maintains membrane identity and membrane protein composition. On the other hand, a previous study reveled that the movement of NHA in the plasma membrane is in accordance to the involvement of a tethering mechanism that prevents the free diffusion in the membrane. Furthermore we have characterized in detail the dynamic behavior of actin filaments and microtubules using transiently transformed pollen tubes with Lat52::GFP::NtADF1 and Lat52::GFP::EB1, respectively. This is the first study in which microtubule dynamics is described in pollen tubes. A second approach was developed in order to determine which components of the cytoskeleton are involved in the maintenance of the H+ATPase, NHA, in a polarized localization in the plasma membrane. A yeast two-hybrid screen was started, using the cytoplasmic regions of the NHA as baits, and a cDNA library from Nicotiana tabacum pollen grains, as the prey.A polaridade celular reflecte a acçao combinatória de mecanismos complexos que estabalecem e mantem domínios funcionais especializados na membrana plasmática e no citoplasma. Os tubos polínicos são um dos molelos mais estimulantes para o estudo dos processos de polaridade em plantas, uma vez que o crescimento apical e acompanhado por características estruturais, nomeadamente o citoesqueleto, a zonação citoplasmática e um padrão polarizado de fluxos de protões (H+) extracelulares. O principal objectivo deste projecto concentrou-se na determinação dos mecanismos envolvidos na regulação do padrão extracellular de protões, em tubos polínicos. O citoesqueleto desempenha um papel essencial no crescimento polarizado, sendo também um elemento estrutural essencial.
Neste estudo foi testada a hipótese do citoesqueleto participar na regulação do padrão de fluxos de protões, nomeadamente através do seu envolvimento na regulação da localização das proteínas envolvidas no transporte de protões para fora da célula, as H+-ATPases. Esta escolha foi baseada na identificação e caracterização recente de uma ATPase protónica especifica de tubos polínicos de Nicotiana tabacum, denominada NHA, pelo grupo de acolhimento. A primeira abordagem consistiu na avaliação do padrão extracellular de protões em resposta a perturbação do citoesqueleto de actina e dos microtúbulos, utilizando uma micro-sonda vibráctil selectiva para protões. Os tubos polínicos de Nicotiana tabacum revelam 3 domínios membranares: o domínio apical, que apresenta influxos de protões; as regiões posteriores do tubo (desde 30 µm atras do ápice, estendendo-se até à base) e grão, com efluxos de protões; e uma área entre as duas descritas anteriormente (aproximadamente (aproximadamente a 20 m do ápice), em que os fluxos de entrada e saída de protões são inexistentes ou estão em equilíbrio, revelando-se sem qualquer fluxo mensurável deste ião. A visualização das bombas protónicas NHA foi realizada em tubos polínicos transformados transientemente com a construção Lat52::NHA::GFP. A NHA apresenta uma distribuição polarizada, estando em perfeita concordância com os fluxos de protões medidos extracelularmente. Esta proteína não é detectada no ápice do tubo, formando um gradiente de acumulação desde o ápice até aproximadamente 20 m atras desta região, onde os níveis de acumulação atingem um máximo, que se estende por todo o tubo ate ao grão. Alterações no citoesqueleto de actina promovem a alteração do padrão de fluxos protónicos, como resultado de alterações na distribuição das H+-ATPases. As alterações induzidas exclusivamente na dinâmica de microtúbulos não têm consequências nos fluxos extracelulares de protões. Podemos concluir que esta estrutura per se não esta envolvida na regulação dos fluxos extracelulares de protões. Contrariamente, a inibição simultânea de filamentos de actina e MTs revela uma diminuição do limiar de concentrações das drogas que inibem os MTs. Nestas situações verificam-se alterações no padrão de fluxos protónicos em tubos polínicos, em contraposição a inibição exclusiva dos MTs, que não induz alteração do padrão. Estes resultados abrem novas perspectivas para o papel dos microtúbulos em tubos polínicos. Dois mecanismos possíveis poderão actuar de forma conjunta. E conhecido o papel do citoesqueleto de actina na remoção de excesso de membrana nas células, que e responsável por manter a identidade membranar, e a composição de proteínas na membrana. Por outro lado, um estudo anterior demostrou que as taxas de movimentação da bomba protónica NHA na membrana plasmática, estão de acordo com taxas de movimentação de proteínas, já descritas noutros sistemas biológicos, em que mecanismos de ancoragem estão presentes, impedindo o seu movimento livre ao longo da membrana. Neste trabalho foi também caracterizado o comportamento dinâmico dos filamentos de actina, bem como o dos microtúbulos. A visualização dos elementos do citoesqueleto foi realizada recorrendo a transformação transiente de tubos polínicos com as construções, Lat52::GFP::NtADF1 e Lat52::GFP::EB1 para actina e microtúbulos, respectivamente. Este torna-se o primeiro trabalho conhecido, onde a dinâmica de microtúbulos e abordada em tubos polínicos. Uma segunda abordagem foi desenvolvida por forma a determinar quais os componentes do citoesqueleto que estão envolvidos na manutenção das bombas protónicas NHA, com uma localização polarizada na membrana plasmática. Foi iniciado um estudo usando o método de “yeast 2-hybrid”, tendo as regiões citoplasmáticas da NHA como “isco” e uma biblioteca de cDNA de grãos de pólen de Nicotiana tabacum como presas. Os resultados preliminares são discutidos em termos de possíveis mecanismos de modulação da posição das NHA pelo citoesqueleto de actina.
Neste estudo foi testada a hipótese do citoesqueleto participar na regulação do padrão de fluxos de protões, nomeadamente através do seu envolvimento na regulação da localização das proteínas envolvidas no transporte de protões para fora da célula, as H+-ATPases. Esta escolha foi baseada na identificação e caracterização recente de uma ATPase protónica especifica de tubos polínicos de Nicotiana tabacum, denominada NHA, pelo grupo de acolhimento. A primeira abordagem consistiu na avaliação do padrão extracellular de protões em resposta a perturbação do citoesqueleto de actina e dos microtúbulos, utilizando uma micro-sonda vibráctil selectiva para protões. Os tubos polínicos de Nicotiana tabacum revelam 3 domínios membranares: o domínio apical, que apresenta influxos de protões; as regiões posteriores do tubo (desde 30 µm atras do ápice, estendendo-se até à base) e grão, com efluxos de protões; e uma área entre as duas descritas anteriormente (aproximadamente (aproximadamente a 20 m do ápice), em que os fluxos de entrada e saída de protões são inexistentes ou estão em equilíbrio, revelando-se sem qualquer fluxo mensurável deste ião. A visualização das bombas protónicas NHA foi realizada em tubos polínicos transformados transientemente com a construção Lat52::NHA::GFP. A NHA apresenta uma distribuição polarizada, estando em perfeita concordância com os fluxos de protões medidos extracelularmente. Esta proteína não é detectada no ápice do tubo, formando um gradiente de acumulação desde o ápice até aproximadamente 20 m atras desta região, onde os níveis de acumulação atingem um máximo, que se estende por todo o tubo ate ao grão. Alterações no citoesqueleto de actina promovem a alteração do padrão de fluxos protónicos, como resultado de alterações na distribuição das H+-ATPases. As alterações induzidas exclusivamente na dinâmica de microtúbulos não têm consequências nos fluxos extracelulares de protões. Podemos concluir que esta estrutura per se não esta envolvida na regulação dos fluxos extracelulares de protões. Contrariamente, a inibição simultânea de filamentos de actina e MTs revela uma diminuição do limiar de concentrações das drogas que inibem os MTs. Nestas situações verificam-se alterações no padrão de fluxos protónicos em tubos polínicos, em contraposição a inibição exclusiva dos MTs, que não induz alteração do padrão. Estes resultados abrem novas perspectivas para o papel dos microtúbulos em tubos polínicos. Dois mecanismos possíveis poderão actuar de forma conjunta. E conhecido o papel do citoesqueleto de actina na remoção de excesso de membrana nas células, que e responsável por manter a identidade membranar, e a composição de proteínas na membrana. Por outro lado, um estudo anterior demostrou que as taxas de movimentação da bomba protónica NHA na membrana plasmática, estão de acordo com taxas de movimentação de proteínas, já descritas noutros sistemas biológicos, em que mecanismos de ancoragem estão presentes, impedindo o seu movimento livre ao longo da membrana. Neste trabalho foi também caracterizado o comportamento dinâmico dos filamentos de actina, bem como o dos microtúbulos. A visualização dos elementos do citoesqueleto foi realizada recorrendo a transformação transiente de tubos polínicos com as construções, Lat52::GFP::NtADF1 e Lat52::GFP::EB1 para actina e microtúbulos, respectivamente. Este torna-se o primeiro trabalho conhecido, onde a dinâmica de microtúbulos e abordada em tubos polínicos. Uma segunda abordagem foi desenvolvida por forma a determinar quais os componentes do citoesqueleto que estão envolvidos na manutenção das bombas protónicas NHA, com uma localização polarizada na membrana plasmática. Foi iniciado um estudo usando o método de “yeast 2-hybrid”, tendo as regiões citoplasmáticas da NHA como “isco” e uma biblioteca de cDNA de grãos de pólen de Nicotiana tabacum como presas. Os resultados preliminares são discutidos em termos de possíveis mecanismos de modulação da posição das NHA pelo citoesqueleto de actina.
Descrição
Tese de doutoramento em Biologia (Biologia Celular), apresentada à Universidade de Lisboa através da Faculdade de Ciências, 2007
Palavras-chave
Citoesqueleto Protões Polaridade celular Teses de doutoramento - 2007