Biomedical applications of fluorinated ionic liquids as drug delivery systems

Oliveira, Ana Luísa Sabina de

http://hdl.handle.net/10451/54595

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Authors

Oliveira, Ana Luísa Sabina de

Advisor(s)

Pereiro, Ana B.

Gaspar, Maria Manuela

Abstract(s)

Nas últimas décadas, a indústria farmacêutica tem enfrentado desafios difíceis, com o mercado farmacêutico a sofrer uma maior pressão económica devido à redução dos custos na saúde e às altas taxas de insucesso no desenvolvimento de medicamentos em ensaios clínicos. Além disso, a crescente concorrência de medicamentos genéricos levou o número de novas entidades farmacêuticas aprovadas a diminuir, juntamente com o aumento de novos medicamentos genéricos no mercado. De forma a derrotar esses problemas, vários esforços foram feitos pela academia e pela indústria. A procura por entidades farmacêuticas novas e inócuas, juntamente com a recuperação de substâncias já estudadas que apresentem problemas de estabilidade ou solubilidade, são o objetivo atual da indústria. Juntamente com a pressão e o desafio para novos compostos terapêuticos, há um aumento da compra de medicamentos seguros e a necessidade de demostrar não apenas o seu efeito terapêutico de novas drogas, mas também que estas oferecem melhorias significativas quando comparadas com as terapias já existentes. Essa situação, juntamente com a procura da sociedade e das autoridades por medicamentos mais seguros e eficientes, levou ao interesse renovado pelos candidatos a medicamentos proteicos. Devido às novas oportunidades e mercados disponíveis, os produtos biológicos tornaram-se um dos maiores focos da indústria farmacêutica. Proteínas terapêuticas, que são compostos biológicos naturais, surgiram no início da década de 1980 e se tornaram uma solução para quase todos os tipos de doenças. Essas biomoléculas são sujeitas a testes clínicos para o tratamento de cancro, Alzheimer, doenças imunológicas, doenças infeciosas, Parkinson, doenças autoimunes, SIDA/VIH, entre outras. Ainda assim, as desvantagens inerentes, independentemente da aplicação clínica de biomoléculas, melhoraram com o desenvolvimento de novos sistemas de veiculação de fármacos (SVFs), a fim de minimizar efeitos colaterais adversos, melhorar a ação de uma droga através de um início mais rápido, entrega controlada no tempo ou local, ou reduzir a dosagem de medicamentos necessária. Um grupo de proteínas que ganhou destaque devido ao seu potencial para o tratamento de inúmeras doenças é o Interferão (IFN). IFNs são um grupo de proteínas que são produzidas naturalmente por células do sistema imunitário para ajudar o sistema imunológico a lidar com ameaças endógenas , tais como células tumorais, e interferem na replicação celular de agentes patogénicos exógenos, tais como bactérias, vírus e fungos. Os IFNs são utilizados no tratamento de muitas doenças como hepatite, neoplasia intraepitelial cervical e carcinoma escamoso celular cutâneo. No entanto, apesar das diversas aplicações do IFN como um líder biofarmacêutico e do seu elevado potencial, existem algumas restrições sobre sua ampla aplicação em ambientes clínicos, tais como: tempo de semi-vida reduzido e a ocorrência de reações adversas graves, especificamente em altas doses de IFN. Assim, a utilização de SVFs para a entrega do IFN pode ser uma solução para estes desafios. Atualmente, estão em desenvolvimento diversos tipos de plataformas capazes de fazer a entrega de fármacos. No entanto, a maior parte destes SVFs ainda estão em fase de investigação e mesmo os que já chegaram ao mercado apresentam desafios na sua aplicação, em especial no que diz respeito à facilidade de produção dos mesmos. Desta forma, surgiu um interesse renovado nos líquidos iónicos (LIs) como alternativas aos SVFs já existentes. As propriedades físicas e químicas únicas dos LIs têm atraído uma atenção considerável, nos últimos anos, devido ao seu potencial biológico e farmacêutico. O primeiro trabalho onde são usados LIs como SVFs foi relatado em 2010 e, desde então, as publicações que lidam com LIs cresceram exponencialmente. No entanto, ainda há áreas quase inexploradas, como a família de líquidos iónicos fluorados (LIFs). Os LIFs são LIs com cadeias alquílicas fluoradas ligadas a quatro ou mais átomos de carbonos, que foram escolhidos uma vez que combinam as melhores características dos LI convencionais com as melhores características dos surfactantes. O principal objetivo da presente dissertação é o desenvolvimento de um novo SVF mais eficiente para IFN alfa-2b com base em LIFs. Estes compostos apresentam propriedades que os tornam candidatos apelativos para a aplicações na indústria farmacêutica, nomeadamente como SVFs. Assim, destacam-se a variada possibilidade de conjugações possíveis entre aniões e catiões, o que torna as suas características manipuláveis de acordo com a aplicação final desejada, sendo possível ajustar a sua toxicidade, biodegradabilidade, comportamento em solução e hidrofobicidade. Para além disso, a presença das cadeias fluoradas aumenta a atividade surfactante e a capacidade de agregação em estruturas supramoleculares organizadas, tornando-os candidatos ideais para o encapsulamento e entrega de compostos terapêuticos. Este trabalho inclui: a) uma triagem baseada nas propriedades de toxicidade dos LIFs, uma vez que é importante escolher um composto que não apresente toxicidade contra as células humanas e o meio ambiente (Capítulo I); b) uma vez que o comportamento surfactante dos LIFs é importante para encapsular biomoléculas um estudo sobre seu comportamento de agregação em vários fluidos biológicos simulados e tampões foram realizados para avaliar se os LIFs podem ser usados como SVFs (Capítulo II); c) os compostos mais promissores selecionados nos capítulos anteriores foram utilizados para avaliar se a estrutura secundária do IFN é modificada na sua presença e avaliar o encapsulamento de IFN num sistema de entrega baseado em LIFs (Capítulo III). No Capitulo I, foi estudada a ecotoxicidade e a toxicidade de LIFs com base na concentração mínima inibitória (CMI) e na atividade hemolítica. Os resultados obtidos sugerem que a aplicação dos LIFs na indústria farmacêutica é promissora, seja como estabilizadores ou SVFs. Nestes ensaios, o LIF com o melhor potencial antibacteriano foi o [C8C1Im][CF3SO3] capaz de inibir o crescimento de microrganismos (Pseudomonas stutzeri) em concentrações aproximadamente 10 vezes mais baixas que os outros LIFs testados e pode representar uma alternativa aos antibióticos. No entanto, os CMIs determinados correspondem a concentrações muito altas, o que evidencia a natureza “amiga do ambiente” dos LIFs. Relativamente à atividade hemolítica, esta apenas ocorre em concentrações perto ou acima da concentração micelar critica (CMC), visto que estes valores de CMCs são usados como referência para criar sistemas de entrega de fármacos. A hemólise ocorre em concentrações duas vezes superiores à CMC, na qual já foi observado o encapsulamento eficaz da lisozima. Além disso, torna-se claro, baseado nas atividades hemolíticas dos diferentes LIFs, que o [C8C1Im][CF3SO3] é o único composto com potencial para ser usado como um agente antibacteriano sem afetar a integridade das células de hemoglobina. Depois disso, no Capitulo II, foram feitos testes de agregação e poder surfactante dos líquidos iónicos fluorados, baseando-nos nos testes de concentração de agregação critica (CAC) e estudos microscópicos, utilizando a TEM e a EDS. A micelização destes LIFs foi analisada através de ensaios de condutividade, onde se verificou que os perfis de agregação dos LIFs são afetados de forma positiva pelos fluídos biológicos simulados usados neste estudo, potenciando a agregação de diversas estruturas em LIFs em várias concentrações. A alta estabilidade da agregação, onde foi demonstrado ser necessário uma menor quantidade de LIF em tampão para obter o mesmo comportamento que em água, e as dimensões destes agregados, extrapolados através dos valores de α e β comparando com os previamente publicados para água, são benéficos e comprovados como uma vantagem para as aplicações desses LIFs como sistemas de veiculação de fármacos e para o armazenamento de biomoléculas. Nas técnicas de imagem TEM e EDS/EDX foi possível verificar que o IFN interage com o LIF, não se podendo comprovar encapsulamento. Para finalizar o estudo, no Capitulo III, foram estudadas as propriedades do IFN na presença e ausência de LIFs com recurso a dicroísmo circular (CD), o tamanho dos agregados e o possível encapsulação do IFN em LIFs com recurso a dispersão de luz dinâmica (DLS), a eficiência de encapsulamento de IFN em LIFs com recurso a vários métodos tais como Lowry-Folin, ensaio com ácido bicinconínico (BCA), ensaio com ácido bicinconínico-micro (MicroBCA) e ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA), e finalmente, a separação de agregados através de uma coluna de gel. Foi possível concluir, através dos espetros de CD, que o LIF não afeta a estrutura secundária do IFN. Foi possível verificar qualitativamente através de DLS que o IFN sofre interação com o LIF, que foi posteriormente confirmada pela técnica de ELISA. Foi ainda testada a separação dos agregados através da passagem dos mesmos por uma coluna de gel. No entanto, este ensaio não foi bem-sucedido e a separação não foi conseguida. Os resultados obtidos das seções anteriores permitiram concluir que os LIFs selecionados apresentam baixa toxicidade em relação aos seres humanos e ao meio ambiente. O seu poder surfactante é beneficiado pela presença de fluidos simulados biológicos, e não é modificado pela presença de IFN. Além disso, é possível observar que a estrutura secundária do IFN não é modificada pela presença de LIFs. Embora não seja possível confirmar o encapsulamento de IFN em agregados de LIFs, é provável que tenha sido alcançada uma interação entre o LIF e a biomolécula, o que destaca o seu potencial de aplicação no desenvolvimento de DDS. Nas secções a seguir, os conceitos acima mencionados serão abordados detalhadamente.

Over the last decades, the pharmaceutical industry has experienced the most difficult challenges with the pharmaceutical market undergoing increased economic pressure due to reduced healthcare costs and high rates of drugs development failure in clinical trials. Also, the increasing competition from generic medications lead the number of new approved pharmaceutical entities to decrease, along with the increment of new generic drugs in the market. In order to defeat these problems, several efforts have been made by the academia and the industry. The search for new and harmless pharmaceutical entities, along with the recovery of substances already studied with stability or solubility problems are the current aim of the industry. Along with the pressure and challenge for new therapeutic compounds, there is an increase on purchase of safety drugs and a need to show not only their therapeutic effect of new drugs but also that they offer significant improvement when compared to the already existing therapies. This situation, together with the demand of the society and authorities for safer and more efficient drugs, has led to the renewed interest in protein drug candidates. Due to new opportunities and markets available, biological products became one of the greatest focus of the pharmaceutical industry. Therapeutic proteins, which are natural biological compounds, have emerged in the early 1980s and became a solution for almost all kind of diseases. These biomolecules are undergoing clinical trials for the treatment of cancers, Alzheimer’s, immune disorders, infectious diseases, Parkinson’s, autoimmune diseases, AIDS/HIV, among others. Even so, the inherent disadvantages regardless the clinical application of biomolecules, enhanced the development of new drug delivery systems in order to minimize adverse side effects, improve the action of a drug through faster onset, time-controlled or site-specific delivery, or reduce the drug dosage needed. Interferons (IFN) are a group of proteins that occur naturally to help the immune system handle endogenous and exogenous threats to the body. IFNs are used in the treatment of many disorders such as hepatitis, cervical intraepithelial neoplasia and cutaneous squamous cell carcinoma. However, despite the diverse applications of IFN as a leading biopharmaceutical, there are some restrictions about its wide application in clinical settings, such as: short half-life and severe adverse reactions, specifically with high doses of IFN. The unique physical and chemical properties of ionic liquids (ILs) have attracted, in recent years, considerable attention due to their biological and pharmaceutical potential. The first work using ILs as drug delivery systems was reported in 2010 and since then, publications dealing with ILs have grown exponentially. However, there are still areas quasi-unexplored such as the fluorinated ionic liquids (FILs) family, defined as ILs with fluorous tags of four or more carbon atoms. These new FILs combine the best properties of highly fluorinated materials with those of ILs in general. The main goal of the present dissertation is the development of a new and more efficient drug delivery system for IFN alpha-2b based on fluorinated ionic liquids (FILs). This work includes: a) a screening based on the toxicity properties of the FILs, since is important to choose a compounds that does not present toxicity against the human cells and the environment (Chapter I); b) since FILs surfactant behavior is important to encapsulate biomolecules a study about their aggregation behavior in several simulated biological fluids and buffers were performed to evaluate if FILs can be use as DDS (Chapter II); c) the most promisor compounds selected in the previous tasks were used to evaluate if the secondary structure of IFN is modified in their presence and to evaluate the encapsulation of interferon (IFN) in a FIL-based delivery system (Chapter III). The results obtained from the previous sections allowed to conclude that the selected FILs show low toxicity towards humans and the environment. Their surfactant power is benefited from the presence of biological simulated fluids, and it is not impacted by the presence of the IFN. Also, it is possible to observe that the secondary structure of IFN is not impacted from the presence of FILs. Although it is not possible to confirm IFN encapsulation in FILs aggregates, it seems likely that an interaction between the FIL and the biomolecule was achieved which highlights their potential for application in the development of DDS. In the following sections the concepts mentioned in this dissertation will be addressed in detail.