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Publicação
Role of PKD1 and PKD2 on ion currents in renal epithelial cells
| Nome: | Descrição: | Tamanho: | Formato: | |
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Orientador(es)
Resumo(s)
A doença renal policística autossómica dominante (ADPKD) é caracterizada pelo desenvolvimento de cistos renais bilaterais que se expandem continuamente e levam a um comprometimento da função renal, sendo responsável por 10% dos casos que requerem transplante renal. A ADPKD é originada por mutações nos genes PKD1 ou PKD2, cujos produtos proteicos são coletivamente denominados policistinas. É a doença monogénica mais comum a nível mundial (incidência de 1:400-1:1000 indivíduos). A Policistina-1 (PC1) é uma proteína de membrana cuja função não é completamente conhecida. Pensa-se que pode atuar como receptor para um ligando não identificado. Está presente na membrana plasmática, no cílio primário e nos complexos de adesão de células epiteliais polarizadas. A Policistina-2 (PC2 ou TRPP2) é uma proteína associada à membrana, que pertence à família de receptores de potencial transientes (TRP). É caracterizada como um canal catiónico não seletivo com alta afinidade para iões de cálcio (Ca2+). Ainda que PC2 seja encontrada em localizações comuns a
PC1, como a membrana plasmática e o cílio primário, encontra-se maioritariamente em organelos intracelulares como o Complexo de Golgi (GC) e o Retículo Endoplasmático (ER). Diversos estudos sugerem que PC1 e PC2 interagem formando o complexo policístico. No cílio primário pensa-se que estas duas proteínas regulam o fluxo de urina primária que passa ao longo do nefrónio. PC1 funciona então como um sensor graças ao seu amplo domínio extracelular, ativando assim PC2 o que leva a uma entrada de Ca2+ na célula. Uma das principais características da ADPKD é secreção de fluido transepitelial em direção ao lúmen do cisto. Ainda que este não seja um fenómeno comum dos túbulos renais, conhecidos por reabsorverem mais de 99% do filtrado glomerular, vários estudos mostram uma aptidão do epitélio de células com ADPKD para secretarem fluido. É possível que vários transportadores e canais iónicos possam estar alterados em células com fenótipo cístico, como os canais apicais de cloreto (Cl-), que assumem particular relevância nesta situação. O aumento dos níveis de monofosfato cíclico de adenosina (cAMP) nestas células induz a secreção de Cl- através de CFTR (do inglês: Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator). Este processo encontra-se descrito como sendo uma das principais alterações nas células epiteliais de doentes com ADPKD. Contudo, existe alguma heterogeneidade na expressão deste canal iónico no tecido renal, o que levou à hipótese de que outros tipos de canais de Cl- poderiam estar envolvidos nesta doença. A existência de sinalização autócrina e parácrina no rim levou à hipótese da ativação dos canais de Cl- ativados por Ca2+ (CaCC). Mutações no CFTR dão origem à Fibrose Quística (CF), a doença autossómica recessiva com maior mortalidade a nível mundial. Este canal é expresso na membrana apical de vários órgãos, incluindo o rim, nomeadamente nos túbulos proximais, distais e ducto coletor. A sua ativação requer um processo de fosforilação dependente de cAMP. CFTR apresenta uma interação funcional com
outros canais iónicos, nomeadamente os CaCC. Os CaCC são canais iónicos membranares específicos para o transporte de aniões. São expressos numa grande variedade de tecidos e desempenham diversos papeis na célula, incluindo secreção epitelial. Podem ser ativados através de um fluxo de Ca2+ transportado através da membrana plasmática ou por libertação de Ca2+ de organelos intracelulares. As proteínas transmembranares 16 (TMEM16) constituem uma família de dez proteínas homólogas (TMEM16A-K) caracterizadas pela elevada conservação das suas sequências. O membro mais bem estudado desta família é a proteína transmembranar 16 A (TMEM16A). Vários estudos demonstram que TMEM16A conduz correntes de CaCC em vários tipos de tecido, incluindo o rim. Neste órgão, TMEM16A desempenha um papel fundamental na reabsorção de proteínas pelos túbulos proximais e na secreção de protões. Uma interação funcional foi descrita entre CFTR e TMEM16A ao nível do intestino e vias aéreas. Estudos demonstraram que TMEM16A aumenta a libertação de Ca2+ do retículo endoplasmático (ER) ativando assim a sinalização por cAMP. É possível que esta dependência funcional ocorra também a nível renal, particularmente nos pacientes com ADPKD que tem secreção apical de Cl- aumentada e sinalização de Ca2+ anormal. Foi previamente demostrado que tanto PKD1 como PKD2 desempenham um papel fundamental
na regulação da homeostase intracelular de Ca2+. No ER, PKD2 interage com o receptor de inositol trifosfato (IP3R), aumentando assim a libertação de Ca2+ deste organelo, ao contrário do PKD1 que regula negativamente esta interação. PKD2 também regula a concentração de Ca2+ intracelular ([Ca2+]i) ao formar heteodímeros com canais TRP presentes tanto na membrana plasmática como no cílio primário. Assim foi proposto que mutações em PKD1 ou PKD2, via desregulação da [Ca2+]i, podem levar à ativação de vias regulatórias anormais presentes na ADPKD. Contudo os mecanismos moleculares por detrás destes processos não se encontram claros. Deste modo, o objetivo deste trabalho é estudar o processo de desenvolvimento dos cistos, nomeadamente a secreção de Cl- desregulada pela qual a ADPKD é caracterizada. Assim, diferentes técnicas de detecção de transporte iónico foram aplicadas, tendo sido utilizadas para o efeito diferentes modelos de estudo. Em primeiro lugar, foi utilizada uma linha celular M1, originária do ducto coletor de rato com expressão diminuída de Pkd1 e Pkd2, de modo a induzir nas células um fenótipo cístico. As propriedades ao nível de transporte iónico foram medidas utilizando diferentes abordagens. De modo a simular a fisiologia do epitélio renal, as monocamadas celulares foram cultivadas em filtros que permitiram que as células polarizassem e que o transporte de eletrólitos fosse avaliado na Câmara de Ussing. Foram também utilizados ensaios com células isoladas, nomeadamente patch clamp e o ensaio de quenching de YFP. No geral, foi possível que observar que menores níveis de Pkd1 e Pkd2 levam à existência de maiores correntes elétricas, geradas por uma maior atividade de canais iónicos, tanto a nível basal como depois de estimulada a secreção de Cl- via CFTR ou CaCC. Visto que a sinalização de Ca2+ aparenta estar alterada nas células com ADPKD, a [Ca2+]i foi medida nestas células. Menor expressão de Pkd1 levou a maior [Ca2+]i tanto a nível basal como depois de estimulação por agonistas purinérgicos. Estas células também aparentam ter uma maior concentração de Ca2+ no ER ([Ca2+] ER). Os resultados obtidos foram então confirmados utilizando culturas primárias de tecido renal de diferentes modelos animais: ratinhos wild-type (wt) utilizados como controlo; ratinhos com Pkd1 Knockout (KO) específico para o rim, de modo a obter um modelo da doença; e ratinhos com Pkd1 e Tmem16a KO específicos para o rim, que permite perceber a relevância neste CaCC na ADPKD. Estas células foram isoladas a partir do córtex e também da medula renal, o que permitiu perceber se haveria alguma diferença entre as células provenientes de diferentes regiões do rim no que diz respeito ao desenvolvimento de um fenótipo cístico. Utilizando as mesmas técnicas acima mencionadas foi possível verificar que a secreção de Cl- se encontrava aumentada, tanto a nível basal como após estimulação dos CaCC e de CFTR, nas células dos animais com KO no Pkd1. Este efeito é revertido quando as células apresentam o duplo KO para Pkd1 e Tmem16a, mostrando assim a importância deste CaCC para a ADPKD. Os níveis intracelulares de Ca2+ foram também analisados de maneira semelhante ao que foi descrito para a linha celular M1. As células primárias que apresentavam KO de Pkd1 apresentaram uma maior [Ca2+]i e de [Ca2+]ER. Este aumento foi abolido nas células primárias provenientes do animal com Pkd1/Tmem16a KO. Em suma, este estudo permitiu demonstrar que o CFTR e TMEM16A colaboram no aumento da secreção de Cl-, um fenótipo característico da ADPKD. Um aumento dos níveis de Ca2+ tanto a nível citoplasmático como do ER em células com KO de Pkd1 sugere que nestas existe uma maior activação de TMEM16A que, através da sua interação funcional com CFTR, aumenta também a sua atividade. Especula-se que o aumento de [Ca2+ ]i se deve à falta de regulação de PKD2 pela PKD1 que se encontra mutada, levando a uma deslocalização de PKD2 do cílio primário e uma maior presença desta proteína quer a nível da membrana plasmática, quer no ER, o que leva a uma maior [Ca2+]i nestas células. A compreensão da função conjunta que o CFTR e TMEM16A aparentam desempenhar no epitélio de células com fenótipo cístico pode impulsionar o conhecimento acerca desta doença e permitir o desenvolvimento de novas terapias.
Autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD) is characterized by the development of bilateral renal cysts that continuously expand and lead to an impaired renal function. ADPKD is originated by mutations in PKD1 or PKD2 genes, whose protein products are collectively called polycystins. Polycystin-1 (PC1) encodes a membrane protein with large extracellular domains, which probably works as a receptor for an unidentified ligand. Polycystin-2 (PC2) is also a membrane-associated protein that works as a non-selective ion channel with high affinity to calcium ions (Ca2+). Together, these proteins are thought to form a functional complex, which can regulate intracellular Ca2+ signaling. One of the hallmarks of ADPKD is the transepithelial Cl- secretion towards the cyst lumen. This secretion is thought to occur, mainly, through cAMP-gated channel Cystic Fibrosis Transmembrane Regulator (CFTR). CFTR is expressed in the apical membrane of epithelial cells in several tissues, namely in the kidney, and its function is suggested to be upregulated in cystic epithelial cells. However, heterogeneity in CFTR expression suggests that this channel may not be the only one responsible for transepithelial chloride (Cl-) secretion in ADPKD. Additionally, Calcium-activated Cl- channels (CaCC) activated through purinergic receptors seem to play a fundamental role in this process. TMEM16A, a CaCC expressed in kidney epithelial cells, can be, together with CFTR, responsible for Cl- secretion towards the cyst lumen, and, therefore, be involved in cyst development. Having a better understanding of TMEM16A and CFTR role in cyst growth can help in the development of new therapies in order to surpass ADPKD impaired Cl- secretion, hence controlling cyst formation and progression. Here, we show that in the M1 cell line and in primary cultures of kidney cells derived from the renal cortex and medulla, the knockdown of either PKD1 or PKD2 is sufficient to generate a cystic phenotype on cellular level. ADPKD cells have an upregulation of constitutive and stimulated Clsecretion, mainly through CFTR and TMEM16A. Increase Cl- secretion by CFTR and TMEM16A is due to an enhanced Ca2+ signaling. ADPKD representative cells are characterized by an increased Ca2+ concentration in the cytoplasm as well in the ER Ca2+ stores Remarkably, the downregulation of TMEM16A expression rescued the cells from the cystic phenotype, showing a major impact of TMEM16A in this disease, and shedding light towards new therapeutic approaches.
Autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD) is characterized by the development of bilateral renal cysts that continuously expand and lead to an impaired renal function. ADPKD is originated by mutations in PKD1 or PKD2 genes, whose protein products are collectively called polycystins. Polycystin-1 (PC1) encodes a membrane protein with large extracellular domains, which probably works as a receptor for an unidentified ligand. Polycystin-2 (PC2) is also a membrane-associated protein that works as a non-selective ion channel with high affinity to calcium ions (Ca2+). Together, these proteins are thought to form a functional complex, which can regulate intracellular Ca2+ signaling. One of the hallmarks of ADPKD is the transepithelial Cl- secretion towards the cyst lumen. This secretion is thought to occur, mainly, through cAMP-gated channel Cystic Fibrosis Transmembrane Regulator (CFTR). CFTR is expressed in the apical membrane of epithelial cells in several tissues, namely in the kidney, and its function is suggested to be upregulated in cystic epithelial cells. However, heterogeneity in CFTR expression suggests that this channel may not be the only one responsible for transepithelial chloride (Cl-) secretion in ADPKD. Additionally, Calcium-activated Cl- channels (CaCC) activated through purinergic receptors seem to play a fundamental role in this process. TMEM16A, a CaCC expressed in kidney epithelial cells, can be, together with CFTR, responsible for Cl- secretion towards the cyst lumen, and, therefore, be involved in cyst development. Having a better understanding of TMEM16A and CFTR role in cyst growth can help in the development of new therapies in order to surpass ADPKD impaired Cl- secretion, hence controlling cyst formation and progression. Here, we show that in the M1 cell line and in primary cultures of kidney cells derived from the renal cortex and medulla, the knockdown of either PKD1 or PKD2 is sufficient to generate a cystic phenotype on cellular level. ADPKD cells have an upregulation of constitutive and stimulated Clsecretion, mainly through CFTR and TMEM16A. Increase Cl- secretion by CFTR and TMEM16A is due to an enhanced Ca2+ signaling. ADPKD representative cells are characterized by an increased Ca2+ concentration in the cytoplasm as well in the ER Ca2+ stores Remarkably, the downregulation of TMEM16A expression rescued the cells from the cystic phenotype, showing a major impact of TMEM16A in this disease, and shedding light towards new therapeutic approaches.
Descrição
Tese de mestrado em Bioquímica, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, em 2018
Palavras-chave
ADPKD TMEM16A CFTR Secreção de Cl- Sinalização de Ca2+ Teses de mestrado - 2018