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Synthesis and evaluation of chemical probes to study the biology of liver stage malaria parasites
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Malaria remains one of the most prevalent and life-threatening diseases. It is caused by infection with parasites of the genus Plasmodium and transmitted to humans through female Anopheles mosquitoes. Several species of Plasmodium cause malaria in humans but P. falciparum is the most lethal specie. Malaria parasites have a complex life cycle and in order to eradicate the disease, every stages should be considered for treatment. Due to the appearance and spread of resistant parasites to current therapies, it is urgent to discover novel antimalarial drugs that are effective against both blood and liver stages of infection by malaria parasites and endowed with the ability to block the transmission of the disease to mosquito vectors. Currently, artemisinin-based combination therapies are used for uncomplicated malaria. The endoperoxide bond of artemisinin plays a key role in the fight against disease. As it only activated by a high concentration of iron (II) that is present in the digestive vacuole of the parasites infecting erythrocytes, where they degrade host hemoglobin. In contrast, basal Fe (II) concentration in mammalian cells is very low. This particularity ensures the high selectivity of endoperoxide drugs. The goal of this work was to prepare an activity-based probe (ABP) designed to identify potential molecular targets of 1,2,4,5-tetraoxane-cyanopyrimidine hybrid antimalarials. Several of these hybrids have shown to be active against the blood and liver stages of malaria parasites, and thus identification of the molecular targets associated to this dual-activity profile may become relevant in the discovery of new antimalarial drugs to be used in eradication campaigns. A hybrid ABP combining the 1,2,4,5-tetraoxane core and a cyanopyrimidine containing an alkyne handle for click chemistry was designed and synthesized. The tetraoxane contained an adamantyl moiety to confer stability to the endoperoxide motif. The synthesis of a negative ABP tetraoxane-pyrimidine nitrile probe was performed. Finally, in order to monitor the distribution and accumulation of this compound, we coupled the ABP with a fluorescent NBD-based azide reagent via click (CuAAC) chemistry to give the corresponding hybrid fluorescent probe in moderate yields.
A malária é uma das doenças infeciosas mais frequente em todo o mundo que afeta maioritariamente as regiões subdesenvolvidas. Segundo a Organização Mundial de Saúde, em 2015 surgiram cerca de 212 milhões de novos casos de malária e estima-se que no mesmo ano tenham ocorrido cerca de 429 mil mortes causadas pela malária. No entanto, não é possível conhecer-se o número exato de casos de malária porque a maioria das regiões endémicas de malária não possuem os recursos de diagnóstico necessários e ainda devido ao facto dos sintomas da doença serem bastante semelhantes a outras doenças existentes nas mesmas regiões. Esta doença é causada por parasitas protozoários do género Plasmodium e sabe-se que existem pelo menos cinco espécies responsáveis pela infeção em humanos, o P. vivax, P. falciparum, P. malariae, P. ovale e P. knowlesi. Em conjunto com o P. vivax, o P. falciparum é também o responsável pela maioria de casos de malária. Apesar do P. falciparum ser a espécie responsável pela malária mais severa e por isso o responsável pela maioria das mortes, o P. vivax consegue gerar formas latentes, os hipnozoitos, que podem voltar à circulação levando à recorrência da doença. Sendo parasitas, os Plasmodium necessitam de dois hospedeiros para se multiplicarem e desenvolverem, um mosquito e um humano. A malária é geralmente transmitida através da picada de uma fémea infetada do mosquito Anopheles, sendo que a espécie mais eficiente é o Anopheles gambiae. Assim que o mosquito se alimenta do sangue humano liberta esporozoítos presentes nas glândulas salivares que migram pela corrente sanguínea e se depositam nas células hepáticas. O ciclo de vida do parasita é complexo passando por uma fase hepática onde o parasita se reproduz assexuadamente nos hepatócitos, seguindo-se uma fase sanguínea. A fase hepática é assintomática surgindo apenas sintomas na fase sanguínea. É nesta segunda fase que também se formam as formas sexuais do parasita capazes de infetar outro mosquito continuando assim o ciclo de vida do Plasmodium. Apesar dos diversos esforços, atualmente não existe nenhuma terapia eficaz no tratamento da malária. Esta ineficácia pode-se dever a diversos fatores como a biologia e ecologia complexa dos parasitas Plasmodium e dos vetores Anopheles e o aparecimento de estirpes de parasitas resistentes aos fármacos. O tratamento na fase hepática tem sido a maior preocupação já que nesta fase o numero de parasitas não é tão elevado como na fase sanguínea. O desenvolvimento de fármacos antimaláricos tem sido maioritariamente focado na fase sanguínea do parasita da malária, mas a fase hepática da infeção do Plasmodium é um passo obrigatório para a maturação e replicação do parasita sendo por isso um alvo importante para a erradicação da malária. Durante a fase sanguínea da malária, os parasitas transportam hemoglobina para o vacúolo digestivo onde usam a hemoglobina como uma fonte essencial de aminoácidos. Esta degradação conduz à formação de ferro heme. O ferro heme é tóxico para o parasita, mas este consegue polimerizá-lo convertendo-o em hemozoína, um material biocristalino inerte. Os primeiros compostos descobertos para o tratamento da malária foram as quinolinas. Após diversas alterações estruturais sintetizou-se um composto chamado cloroquina. A cloroquina tem sido utilizada no tratamento da malária desde os anos 60 e apesar das suas inúmeras vantagens como a eficácia, segurança e a possibilidade de administração a mulheres grávidas e crianças, o aparecimento de estirpes resistentes à cloroquina tornou necessária a procura de novos fármacos. A descoberta do mecanismo de ativação da artemisinina pelo ferro do grupo heme e da importância do núcleo endoperoxídico para a atividade antimalárica levou à descoberta dos tetraoxanos como potenciais fármacos para o tratamento da malária. Após serem ativados pelo ferro, os endoperóxidos dão origem a radicais centrados no carbono e a espécies reativas de oxigénio capazes de causar stress oxidativo no parasita. Este método de ativação permite que os endopéroxidos sejam seletivos para o parasita já que são necessários elevados níveis de ferro heme no vacúolo digestivo que, em condições normais, não se encontram nas células mamíferas. Atualmente, a artemisinina não é utilizada devido ao seu perfil farmacocinético fraco como o baixo tempo de semi-vida, a pobre solubilidade e a baixa biodisponibilidade tendo sido por isso sintetizados derivados semissintéticos. Estes derivados semissintéticos podem ser utilizados em terapias combinadas com outros agentes antimaláricos de longa ação permitindo a eliminação eficaz do parasita e evitando o aparecimento de casos de malária resistentes a esta terapia. No entanto, foram já documentados os primeiros casos de resistência à artemisinina. Um dos derivados semissintéticos da artemisinina, o arteméter, é atualmente utilizado em terapia combinada com a lumefantrina (Coartem©) para o tratamento da malária descomplicada em adultos e em crianças. Devido ao aumento das espécies resistentes aos fármacos antimaláricos, a síntese de compostos híbridos com um mecanismo de ação duplo tem se tornado uma abordagem bastante promissora. Desta forma, sintetizou-se um tetraoxano que após ativação com o ferro leva à formação de dois compostos, uma molécula radicalar e altamente reativa capaz de alquilar biomoléculas essenciais para a sobrevivência do parasita e aumentar o stress oxidativo e uma segunda molécula capaz de inibir enzimas como a falcipaína. A falcipaína é uma família de proteases de cisteína que se encontram no vacúolo digestivo e que desempenham um papel muito importante na hidrólise da hemoglobina. A inibição da falcipaína impede que o parasita consiga degradar a hemoglobina em aminoácidos conduzindo à sua morte. Diversos inibidores de proteases de cisteína têm sido sintetizados com bons resultados in vitro e in vivo com uma característica comum, um grupo eletrofílico capaz de reagir com o resíduo de cisteína. Recentemente, foi descoberto um novo grupo de tetraoxanos híbridos ativados pelo ferro, capazes de inibir a falcipaína dentro do vacúolo digestivo do parasita, os tetraoxanos compostos por pirimidinas e nitrilos. O ataque nucleofílico pelos nitrilos no sítio ativo das proteases de cisteína resulta na inibição reversível e covalente das enzimas. O objetivo deste trabalho foi preparar uma sonda baseada na atividade (activity-based probe, ABP), projetada para identificar potenciais alvos moleculares de 1,2,4,5-tetraoxanos híbridos antimaláricos. Para a obtenção do composto pretendido recorreu-se a um processo de síntese bastante extenso realizado em duas fases separadas. Primeiro realizou-se a síntese do tetraoxano e do núcleo pirimidínico e no fim, fez-se o acoplamento entre os dois. Os rendimentos de todos os passos de síntese realizados foram moderados a bons tendo-se conseguido sintetizar o composto pretendido. De forma a monitorizar e observar a distribuição e acumulação do nosso composto dentro dos parasitas, decidiu-se acoplar a ABP a uma sonda fluorescente. Após a síntese da sonda, esta foi acoplada à ABP através de química click. Esta reação realizou-se por uma cicloadição catalisada por cobre entre a azida da sonda e o alcino do tetraoxano. O facto das azidas e dos alcinos serem inertes na maioria das condições biológicas e orgânicas permite que este acoplamento ocorra dentro do sistema vivo sem interferir com os processos bioquímicos naturais por reações bioortogonais. Apesar de ter ocorrido reação e de se ter sintetizado o composto pretendido, o rendimento deste acoplamento foi baixo tendo por isso a necessidade de ser otimizado. Neste projeto, pretendia-se ainda sintetizar um análogo do nosso tetraoxano inativo. A síntese deste análogo teve rendimentos moderados a altos mas não foi completa.
A malária é uma das doenças infeciosas mais frequente em todo o mundo que afeta maioritariamente as regiões subdesenvolvidas. Segundo a Organização Mundial de Saúde, em 2015 surgiram cerca de 212 milhões de novos casos de malária e estima-se que no mesmo ano tenham ocorrido cerca de 429 mil mortes causadas pela malária. No entanto, não é possível conhecer-se o número exato de casos de malária porque a maioria das regiões endémicas de malária não possuem os recursos de diagnóstico necessários e ainda devido ao facto dos sintomas da doença serem bastante semelhantes a outras doenças existentes nas mesmas regiões. Esta doença é causada por parasitas protozoários do género Plasmodium e sabe-se que existem pelo menos cinco espécies responsáveis pela infeção em humanos, o P. vivax, P. falciparum, P. malariae, P. ovale e P. knowlesi. Em conjunto com o P. vivax, o P. falciparum é também o responsável pela maioria de casos de malária. Apesar do P. falciparum ser a espécie responsável pela malária mais severa e por isso o responsável pela maioria das mortes, o P. vivax consegue gerar formas latentes, os hipnozoitos, que podem voltar à circulação levando à recorrência da doença. Sendo parasitas, os Plasmodium necessitam de dois hospedeiros para se multiplicarem e desenvolverem, um mosquito e um humano. A malária é geralmente transmitida através da picada de uma fémea infetada do mosquito Anopheles, sendo que a espécie mais eficiente é o Anopheles gambiae. Assim que o mosquito se alimenta do sangue humano liberta esporozoítos presentes nas glândulas salivares que migram pela corrente sanguínea e se depositam nas células hepáticas. O ciclo de vida do parasita é complexo passando por uma fase hepática onde o parasita se reproduz assexuadamente nos hepatócitos, seguindo-se uma fase sanguínea. A fase hepática é assintomática surgindo apenas sintomas na fase sanguínea. É nesta segunda fase que também se formam as formas sexuais do parasita capazes de infetar outro mosquito continuando assim o ciclo de vida do Plasmodium. Apesar dos diversos esforços, atualmente não existe nenhuma terapia eficaz no tratamento da malária. Esta ineficácia pode-se dever a diversos fatores como a biologia e ecologia complexa dos parasitas Plasmodium e dos vetores Anopheles e o aparecimento de estirpes de parasitas resistentes aos fármacos. O tratamento na fase hepática tem sido a maior preocupação já que nesta fase o numero de parasitas não é tão elevado como na fase sanguínea. O desenvolvimento de fármacos antimaláricos tem sido maioritariamente focado na fase sanguínea do parasita da malária, mas a fase hepática da infeção do Plasmodium é um passo obrigatório para a maturação e replicação do parasita sendo por isso um alvo importante para a erradicação da malária. Durante a fase sanguínea da malária, os parasitas transportam hemoglobina para o vacúolo digestivo onde usam a hemoglobina como uma fonte essencial de aminoácidos. Esta degradação conduz à formação de ferro heme. O ferro heme é tóxico para o parasita, mas este consegue polimerizá-lo convertendo-o em hemozoína, um material biocristalino inerte. Os primeiros compostos descobertos para o tratamento da malária foram as quinolinas. Após diversas alterações estruturais sintetizou-se um composto chamado cloroquina. A cloroquina tem sido utilizada no tratamento da malária desde os anos 60 e apesar das suas inúmeras vantagens como a eficácia, segurança e a possibilidade de administração a mulheres grávidas e crianças, o aparecimento de estirpes resistentes à cloroquina tornou necessária a procura de novos fármacos. A descoberta do mecanismo de ativação da artemisinina pelo ferro do grupo heme e da importância do núcleo endoperoxídico para a atividade antimalárica levou à descoberta dos tetraoxanos como potenciais fármacos para o tratamento da malária. Após serem ativados pelo ferro, os endoperóxidos dão origem a radicais centrados no carbono e a espécies reativas de oxigénio capazes de causar stress oxidativo no parasita. Este método de ativação permite que os endopéroxidos sejam seletivos para o parasita já que são necessários elevados níveis de ferro heme no vacúolo digestivo que, em condições normais, não se encontram nas células mamíferas. Atualmente, a artemisinina não é utilizada devido ao seu perfil farmacocinético fraco como o baixo tempo de semi-vida, a pobre solubilidade e a baixa biodisponibilidade tendo sido por isso sintetizados derivados semissintéticos. Estes derivados semissintéticos podem ser utilizados em terapias combinadas com outros agentes antimaláricos de longa ação permitindo a eliminação eficaz do parasita e evitando o aparecimento de casos de malária resistentes a esta terapia. No entanto, foram já documentados os primeiros casos de resistência à artemisinina. Um dos derivados semissintéticos da artemisinina, o arteméter, é atualmente utilizado em terapia combinada com a lumefantrina (Coartem©) para o tratamento da malária descomplicada em adultos e em crianças. Devido ao aumento das espécies resistentes aos fármacos antimaláricos, a síntese de compostos híbridos com um mecanismo de ação duplo tem se tornado uma abordagem bastante promissora. Desta forma, sintetizou-se um tetraoxano que após ativação com o ferro leva à formação de dois compostos, uma molécula radicalar e altamente reativa capaz de alquilar biomoléculas essenciais para a sobrevivência do parasita e aumentar o stress oxidativo e uma segunda molécula capaz de inibir enzimas como a falcipaína. A falcipaína é uma família de proteases de cisteína que se encontram no vacúolo digestivo e que desempenham um papel muito importante na hidrólise da hemoglobina. A inibição da falcipaína impede que o parasita consiga degradar a hemoglobina em aminoácidos conduzindo à sua morte. Diversos inibidores de proteases de cisteína têm sido sintetizados com bons resultados in vitro e in vivo com uma característica comum, um grupo eletrofílico capaz de reagir com o resíduo de cisteína. Recentemente, foi descoberto um novo grupo de tetraoxanos híbridos ativados pelo ferro, capazes de inibir a falcipaína dentro do vacúolo digestivo do parasita, os tetraoxanos compostos por pirimidinas e nitrilos. O ataque nucleofílico pelos nitrilos no sítio ativo das proteases de cisteína resulta na inibição reversível e covalente das enzimas. O objetivo deste trabalho foi preparar uma sonda baseada na atividade (activity-based probe, ABP), projetada para identificar potenciais alvos moleculares de 1,2,4,5-tetraoxanos híbridos antimaláricos. Para a obtenção do composto pretendido recorreu-se a um processo de síntese bastante extenso realizado em duas fases separadas. Primeiro realizou-se a síntese do tetraoxano e do núcleo pirimidínico e no fim, fez-se o acoplamento entre os dois. Os rendimentos de todos os passos de síntese realizados foram moderados a bons tendo-se conseguido sintetizar o composto pretendido. De forma a monitorizar e observar a distribuição e acumulação do nosso composto dentro dos parasitas, decidiu-se acoplar a ABP a uma sonda fluorescente. Após a síntese da sonda, esta foi acoplada à ABP através de química click. Esta reação realizou-se por uma cicloadição catalisada por cobre entre a azida da sonda e o alcino do tetraoxano. O facto das azidas e dos alcinos serem inertes na maioria das condições biológicas e orgânicas permite que este acoplamento ocorra dentro do sistema vivo sem interferir com os processos bioquímicos naturais por reações bioortogonais. Apesar de ter ocorrido reação e de se ter sintetizado o composto pretendido, o rendimento deste acoplamento foi baixo tendo por isso a necessidade de ser otimizado. Neste projeto, pretendia-se ainda sintetizar um análogo do nosso tetraoxano inativo. A síntese deste análogo teve rendimentos moderados a altos mas não foi completa.
Descrição
Tese de mestrado, Química Farmacêutica e Terapêutica, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2017
Palavras-chave
Malária Tetraoxanos Cianopirimidina Sonda baseada na atividade Teses de mestrado - 2017