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Mechanism of a viral inhibitor of Toll-like receptors activation
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Resumo(s)
African Suine Fever Virus (AFSV) infects macrophages from Sus scrofa individuals (comprising pigs and wild boars), leading to severe haemorrhages and a high mortality of the infected pigs. In Africa, this virus also infects other species from the Suidae family, such as Potamochaerus porcus and Phacochaerus aethiopicus. These animals are the natural reservoir in a sylvatic cycle and show no symptoms of the disease when infected with the virus. This disease is highly transmitted by direct pig to pig contact and by infected Ornithodoros soft ticks. Currently, an outbreak has been spreading from Eastern Europe, constituting a serious threat to the rest of the Europe. Sadly, there is not a vaccine yet, which is an urgent necessity, not only because pork is an important source of meat for humans, but also to protect wild boar subspecies and pig breeds. AFSV is a member of Asfarviridae family with a large icosahedral enveloped dsDNA virion, encoding for almost 200 proteins, depending on the isolate. Many of these proteins have evolved for manipulation of host cell biology and immunology, which several dedicated to inhibition of the interferon response14. These proteins confer an advantage to the virus through inhibition of the major antivirus immune response. Developing a live attenuated viral vaccine through gene deletion of one or more virus genes inhibiting the interferon response is a practical solution The ASFV transmembrane protein I329L, the focus of my thesis, was shown by our lab to have a slight homology to the Toll-like receptor 3 (TLR3) and, more importantly, to inhibit TLR3-mediated interferon production, and is therefore a candidate for construction of a gene deletion attenuated viral vaccine. Personal communication from the current research group shows an attempt to address a differential gene expression in cells expressing the viral protein I329L using DNA Microarray Analysis. However, no differential gene expression was observed. Thus, the objective of my project is to establish appropriate experimental approaches to test the mechanism of the I329L-mediated inhibition of the TLr3 response.
O vírus da Peste suína africana (VPSA) apresenta um elevado tropismo para macrófagos e infecta indivíduos da espécie Sus scrofa, que inclui javalis e porcos, levando a hemorragias severas e a uma elevada taxa de mortalidade dos indivíduos infectados. Esta doença é altamente transmitida entre indivíduos e através de carraças do género Ornithodoros. Vários surtos ocorreram já, mas felizmente foram erradicados. Contudo, em 2007 na Geórgia, apareceu um surto preocupante que continua a avançar desde a Europa de Leste para o resto da Europa. A situação é alarmante porque não existe ainda vacina para esta doença. É necessário criar uma vacina tanto para proteger os porcos enquanto uma das principais fontes de alimentação para os humanos, como também para proteger e manter o património ecológico e genético das subespécies de javali e das raças de porco de forma sustentável. Em África, este vírus infecta outras espécies da família Suidae, como o Potamocherus porcus e o Phacochoerus aehtiopicus, que servem de reservatório natural num ciclo silvático sem mostrarem qualquer tipo de sintoma. O VPSA é um membro da família Asfarviridae e apresenta um virião icosaédrico, com invólucro e DNA em cadeia dupla que codifica para quase 200 proteínas, dependendo do isolado. Este vírus é responsável pela inibição da produção de interferão do tipo I e um número muito grande destas proteínas está envolvida nesta inibição da resposta imunitária. Contudo, não se conhecem ainda em detalhe os mecanismos de inibição viral, envolvendo tanto respostas serológicas como celulares. Assim, o objectivo dos vários grupos de investigação na área do VPSA é estudar as proteínas deste vírus quanto ao mecanismo de inibição da resposta imunitária para se poder criar uma vacina viva de uma versão atenuada do vírus. Esta versão atenuada do vírus deverá conter o mínimo de delecções no seu genoma de genes que codificam para essas proteínas. Assim, é possível induzir uma resposta imunitária que reconheça o máximo de antigénios e que não seja inibida pelo vírus. A proteína do VPSA em foco na minha tese é a proteína transmembranar I329L, que apresenta um domínio intracelular (DIC) e um domínio extracelular (DEC). O DIC apresenta um domínio do tipo receptor Toll/interleucina-1 (TIR) e o DEC apresenta domínios de repetições ricas em leucinas (LRR). Estado da arte mostra que a I329L é capaz de subverter a resposta imune, inibindo a produção de interferão do tipo I. Assim, o laboratório pretendeu saber qual o mecanismo pelo qual a I329L é capaz de subverter a resposta imune. Sabendo que os porcos são vertebrados e que as carraças são invertebrados, e que o VPSA infecta tanto porcos como carraças, então o VPSA infecta tanto vertebrados como invertebrados. A resposta imunitária que é comum tanto vertebrados como invertebrados é a imunidade inata. Deste modo, é necessário procurar homologias da proteína viral I329L com proteínas envolvidas na resposta imune inata. O grupo de investigação no qual decorre este projecto descobriu que a proteína I329L apresenta uma homologia vestigial com o receptor do tipo Toll 3 (TLR3). Os receptores do tipo Toll (TLR) são receptores da imunidade inata. Os TLR são também proteínas transmembranares que apresentam um domínio rico em leucinas e um domínio TIR. Estes receptores activam-se por homodimerização após ligação de um ligando específico de cada TLR. A homologia, apesar de vestigial, entre a proteína I329L e o receptor TLR3 encontra-se entre o domínio TIR do TLR3 e o domínio do tipo TIR da I329L, no domínio extracelular de cada um. O TLR3 é activado por RNA em cadeia dupla e utiliza a proteína TRIF (proteína adaptadora indutora de interferão β e que contém o domínio TIR) como proteína principal a jusante na via. A sinalização do TLR3 divide-se numa via que utiliza a TRIF como proteína sinalizadora e noutra que é independente desta e que se serve da Src para regular a célula ao nível do ciclo celular e da locomoção. A Src, ao activar-se, autofosforila-se na tirosina 416. A via de sinalização do TLR3 pela TRIF culminará, por um lado, na degradação do IκB e na libertação do NF-κB, que migra para o núcleo e actua como factor de transcrição, permitindo a expressão de citocinas pró-inflamatórias. Por outro lado, a via de sinalização do TLR3 pela TRIF leva a que o IRF3 seja enviado para o núcleo para actuar como factor de transcrição, permitindo a expressão de interferão do tipo I, e consequentemente, de genes estimulados por interferão. Através de ensaios que utilizam luciferase como repórter em fusão com o promotor de genes estimulados por interferão (ISGs), é possível quantificar de forma relativa a activação e a inibição da via de sinalização do TLR3. Utilizando como indutores da via o poli(I:C) (análogo artificial do RNA em cadeia dupla) e TRIF expressa ectopicamente e células transfectadas com apenas um dos domínios, o grupo concluiu que a I329L inibe a via de sinalização do TLR3 com o domínio intracelular, ligando-se ao domínio TIR do TLR3 e talvez à própria TRIF. Ainda, é possível que o domínio extracelular do I329L dimerize com o TLR3, impedindo a sua activação. Com isto, o laboratório em que a investigação deste projecto decorre pretendeu perceber mais a fundo o impacto da I329L, não só na via de sinalização do TLR3, como também noutras vias celulares. Assim, o laboratório pretendeu analisar o impacto da I329L nos perfis de expressão génica e de fosforilação de péptidos na célula. Recorrendo a amostras de células induzidas com poli(I:C), ou não, e expressando a I329L, ou não, o grupo quis analisar o impacto da I329L na expressão génica na célula enviando estas amostras para serem analisadas por ensaio de microarranjo de DNA. A activação da via de sinalização do TLR3 e da sua inibição pela I329L nestas amostras foram confirmadas por ensaio de repórter de luciferase antes de serem enviadas. O resultado do ensaio de microarranjo de DNA mostrou que não houve nenhuma diferença na expressão de genes das amostras em relação ao controlo (células não induzidas por poli(I:C) e não transfectadas com I329L). Assim, o objectivo da minha tese é testar a activação da sinalização do TLR3 e a sua inibição pela proteína viral I329L usando técnicas baratas. Para tal, é necessário primeiro que o sistema de activação e inibição pela I329L da via de sinalização do TLR3 seja observável. Assim, para testar as células antes de as analisar por análise de microarranjo de DNA e por espectrometria de massa, que são técnicas caras, preciso de confirmar a activação e a inibição por I329L nas células com técnicas económicas disponíveis no laboratório. Essas técnicas são o ensaio de repórter de luciferase, immunoblot para o IκB, immunoblot para Src fosforilada na tirosina 416 e PCR de transcrição reversa para avaliar a expressão de genes estimulados por interferão. As células utilizadas até então, as HEK-293T, não expressam TLR3, tendo que ser sempre transfectadas com plasmídeos que expressam o TLR3. As HEK-293T não mostravam mais a via de sinalização do TLR3 activada. Deste modo, testei outras linhas celulares. Em adição, procurei saber se o problema de activação das células residia na expressão do TLR3 e na degradação do poli(I:C). Os resultados mostraram que algumas linhas celulares apresentam activação da via de sinalização, como as linhas Cos1 e RPE1. A inibição da via de sinalização do receptor TLR3 pela proteína viral I329L foi também testada em células RPE1, mas sem mostrar a via inibida.
O vírus da Peste suína africana (VPSA) apresenta um elevado tropismo para macrófagos e infecta indivíduos da espécie Sus scrofa, que inclui javalis e porcos, levando a hemorragias severas e a uma elevada taxa de mortalidade dos indivíduos infectados. Esta doença é altamente transmitida entre indivíduos e através de carraças do género Ornithodoros. Vários surtos ocorreram já, mas felizmente foram erradicados. Contudo, em 2007 na Geórgia, apareceu um surto preocupante que continua a avançar desde a Europa de Leste para o resto da Europa. A situação é alarmante porque não existe ainda vacina para esta doença. É necessário criar uma vacina tanto para proteger os porcos enquanto uma das principais fontes de alimentação para os humanos, como também para proteger e manter o património ecológico e genético das subespécies de javali e das raças de porco de forma sustentável. Em África, este vírus infecta outras espécies da família Suidae, como o Potamocherus porcus e o Phacochoerus aehtiopicus, que servem de reservatório natural num ciclo silvático sem mostrarem qualquer tipo de sintoma. O VPSA é um membro da família Asfarviridae e apresenta um virião icosaédrico, com invólucro e DNA em cadeia dupla que codifica para quase 200 proteínas, dependendo do isolado. Este vírus é responsável pela inibição da produção de interferão do tipo I e um número muito grande destas proteínas está envolvida nesta inibição da resposta imunitária. Contudo, não se conhecem ainda em detalhe os mecanismos de inibição viral, envolvendo tanto respostas serológicas como celulares. Assim, o objectivo dos vários grupos de investigação na área do VPSA é estudar as proteínas deste vírus quanto ao mecanismo de inibição da resposta imunitária para se poder criar uma vacina viva de uma versão atenuada do vírus. Esta versão atenuada do vírus deverá conter o mínimo de delecções no seu genoma de genes que codificam para essas proteínas. Assim, é possível induzir uma resposta imunitária que reconheça o máximo de antigénios e que não seja inibida pelo vírus. A proteína do VPSA em foco na minha tese é a proteína transmembranar I329L, que apresenta um domínio intracelular (DIC) e um domínio extracelular (DEC). O DIC apresenta um domínio do tipo receptor Toll/interleucina-1 (TIR) e o DEC apresenta domínios de repetições ricas em leucinas (LRR). Estado da arte mostra que a I329L é capaz de subverter a resposta imune, inibindo a produção de interferão do tipo I. Assim, o laboratório pretendeu saber qual o mecanismo pelo qual a I329L é capaz de subverter a resposta imune. Sabendo que os porcos são vertebrados e que as carraças são invertebrados, e que o VPSA infecta tanto porcos como carraças, então o VPSA infecta tanto vertebrados como invertebrados. A resposta imunitária que é comum tanto vertebrados como invertebrados é a imunidade inata. Deste modo, é necessário procurar homologias da proteína viral I329L com proteínas envolvidas na resposta imune inata. O grupo de investigação no qual decorre este projecto descobriu que a proteína I329L apresenta uma homologia vestigial com o receptor do tipo Toll 3 (TLR3). Os receptores do tipo Toll (TLR) são receptores da imunidade inata. Os TLR são também proteínas transmembranares que apresentam um domínio rico em leucinas e um domínio TIR. Estes receptores activam-se por homodimerização após ligação de um ligando específico de cada TLR. A homologia, apesar de vestigial, entre a proteína I329L e o receptor TLR3 encontra-se entre o domínio TIR do TLR3 e o domínio do tipo TIR da I329L, no domínio extracelular de cada um. O TLR3 é activado por RNA em cadeia dupla e utiliza a proteína TRIF (proteína adaptadora indutora de interferão β e que contém o domínio TIR) como proteína principal a jusante na via. A sinalização do TLR3 divide-se numa via que utiliza a TRIF como proteína sinalizadora e noutra que é independente desta e que se serve da Src para regular a célula ao nível do ciclo celular e da locomoção. A Src, ao activar-se, autofosforila-se na tirosina 416. A via de sinalização do TLR3 pela TRIF culminará, por um lado, na degradação do IκB e na libertação do NF-κB, que migra para o núcleo e actua como factor de transcrição, permitindo a expressão de citocinas pró-inflamatórias. Por outro lado, a via de sinalização do TLR3 pela TRIF leva a que o IRF3 seja enviado para o núcleo para actuar como factor de transcrição, permitindo a expressão de interferão do tipo I, e consequentemente, de genes estimulados por interferão. Através de ensaios que utilizam luciferase como repórter em fusão com o promotor de genes estimulados por interferão (ISGs), é possível quantificar de forma relativa a activação e a inibição da via de sinalização do TLR3. Utilizando como indutores da via o poli(I:C) (análogo artificial do RNA em cadeia dupla) e TRIF expressa ectopicamente e células transfectadas com apenas um dos domínios, o grupo concluiu que a I329L inibe a via de sinalização do TLR3 com o domínio intracelular, ligando-se ao domínio TIR do TLR3 e talvez à própria TRIF. Ainda, é possível que o domínio extracelular do I329L dimerize com o TLR3, impedindo a sua activação. Com isto, o laboratório em que a investigação deste projecto decorre pretendeu perceber mais a fundo o impacto da I329L, não só na via de sinalização do TLR3, como também noutras vias celulares. Assim, o laboratório pretendeu analisar o impacto da I329L nos perfis de expressão génica e de fosforilação de péptidos na célula. Recorrendo a amostras de células induzidas com poli(I:C), ou não, e expressando a I329L, ou não, o grupo quis analisar o impacto da I329L na expressão génica na célula enviando estas amostras para serem analisadas por ensaio de microarranjo de DNA. A activação da via de sinalização do TLR3 e da sua inibição pela I329L nestas amostras foram confirmadas por ensaio de repórter de luciferase antes de serem enviadas. O resultado do ensaio de microarranjo de DNA mostrou que não houve nenhuma diferença na expressão de genes das amostras em relação ao controlo (células não induzidas por poli(I:C) e não transfectadas com I329L). Assim, o objectivo da minha tese é testar a activação da sinalização do TLR3 e a sua inibição pela proteína viral I329L usando técnicas baratas. Para tal, é necessário primeiro que o sistema de activação e inibição pela I329L da via de sinalização do TLR3 seja observável. Assim, para testar as células antes de as analisar por análise de microarranjo de DNA e por espectrometria de massa, que são técnicas caras, preciso de confirmar a activação e a inibição por I329L nas células com técnicas económicas disponíveis no laboratório. Essas técnicas são o ensaio de repórter de luciferase, immunoblot para o IκB, immunoblot para Src fosforilada na tirosina 416 e PCR de transcrição reversa para avaliar a expressão de genes estimulados por interferão. As células utilizadas até então, as HEK-293T, não expressam TLR3, tendo que ser sempre transfectadas com plasmídeos que expressam o TLR3. As HEK-293T não mostravam mais a via de sinalização do TLR3 activada. Deste modo, testei outras linhas celulares. Em adição, procurei saber se o problema de activação das células residia na expressão do TLR3 e na degradação do poli(I:C). Os resultados mostraram que algumas linhas celulares apresentam activação da via de sinalização, como as linhas Cos1 e RPE1. A inibição da via de sinalização do receptor TLR3 pela proteína viral I329L foi também testada em células RPE1, mas sem mostrar a via inibida.
Descrição
Tese de mestrado, Biologia Molecular e Genética, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2018
Palavras-chave
Vírus da Peste Suína Africana Via de sinalização do TLR3, I329L Inibição viral Interferão Teses de mestrado - 2018