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Publicação
Investigating the role of p53 mRNA elements on the translation of different oncogenic proteins
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Orientador(es)
Resumo(s)
A expressão génica nos eucariotas é um processo complexo, envolvendo múltiplos passos interconectados que são altamente regulados. A tradução é um destes passos, sendo fundamental para a manutenção da homeostase celular, uma vez que comporta a síntese proteica. O mecanismo de iniciação da tradução canónico, dependente da estrutura cap (guanina metilada, m7G) localizada na extremidade 5’ do ácido ribonucleico mensageiro (mRNA, do inglês messenger ribonucleic acid) é o mais comumente utilizado pelos mRNAs eucariotas. Resumidamente, este mecanismo inicia-se com a formação do complexo ternário, que é formado pelo fator de iniciação da tradução 2 ligado a uma guanosina trifosfato e a uma molécula de RNA de transferência que transporta a metionina da primeira cadeia peptídica. Após a formação deste complexo, dá-se a ligação deste ao mRNA maduro, formando o complexo de preiniciação da tradução 43S que irá reconhecer a estrutura cap com o auxílio de outros fatores de iniciação da tradução, e fazer o rastreamento de toda a região 5’ não-traduzida (UTR, do inglês untranslated region) até à identificação de um codão de iniciação num contexto favorável. Contudo, a iniciação da tradução canónica encontra-se comprometida em determinadas condições celulares, como por exemplo em situações de stresse celular. Nestas condições, em que a tradução está globalmente reduzida, existe uma expressão seletiva de transcritos através de mecanismos alternativos de iniciação da tradução, como é o caso da iniciação da tradução através de locais de entrada internos do ribossoma (IRES, do inglês internal ribosome entry site). Este mecanismo permite o recrutamento interno do ribossoma para a imediação do codão de iniciação, através de estruturas secundárias complexas, de alguns fatores de iniciação e de proteínas auxiliares denominadas de ITAF (do inglês IRES trans-acting factor), suprimindo a necessidade de reconhecimento da estrutura cap e o rastreio da 5’UTR do mRNA. Apesar deste mecanismo ser benéfico e permitir a tradução de transcritos que permitem a recuperação da homeostase celular e ultrapassar os stresses celulares, já foi descrita uma associação entre genes que desempenham um papel importante na carcinogénese e a presença de um elemento IRES no respetivo mRNA. Um exemplo é o gene supressor de tumores p53. A proteína p53 é um importante fator de transcrição de genes que regulam o ciclo celular, a apoptose e a diferenciação celular, desempenhando um papel fundamental na proteção da transformação celular maligna. O gene p53 dá origem a várias isoformas proteicas que desempenham diferentes funções celulares. No total já foram descritas pelo menos quinze isoformas diferentes que resultam de splicing alternativo, do uso de promotores alternativos e da iniciação da tradução interna mediada por IRES. Foi descrita a presença de dois IRES no mRNA do p53 capazes de regular a tradução do FL-p53 (do inglês full-length p53) e da isoforma Δ40p53 (isoforma ∆40p53 truncada no N-terminal do FL-p3). Mais recentemente, o nosso laboratório identificou um terceiro IRES responsável pela tradução de uma isoforma mais curta, o Δ160p53 (isoforma ∆160p53 truncada no N-terminal do FL-p3). O nosso laboratório também associou a expressão de isoformas, nomeadamente a isoforma Δ160p53, com funções oncogénicas na presença de mutações missense no gene p53 comuns em cancro. Considerando a informação descrita, esta tese teve como objetivo principal testar a função inibitória de um elemento presente no mRNA do p53 sobre a atividade de diferentes IRES, nomeadamente IRES presentes no mRNA de proteínas oncogénicas, e o estudo dos mecanismos moleculares adjacentes a esta função inibitória. Para tal, recorremos à utilização de um vetor bicistrónico, que contem dois genes repórteres, o gene da luciferase da medusa Renilla reniformis (RLuc, do inglês Renilla luciferase) e o gene da luciferase do pirilampo Photynus pyralis (FLuc, do inglês firefly luciferase). O primeiro cistrão corresponde à sequência codificante da RLuc, e é traduzido por mecanismos dependentes da estrutura cap, sendo que o segundo cistrão, que corresponde à sequência codificante da FLuc, é apenas traduzido por mecanismos que permitam uma iniciação da tradução interna, como é o caso da tradução mediada pelo IRES. A presença de um hairpin (estrutura secundária em loop) a jusante da RLuc previne a reiniciação da tradução, garantindo que a expressão da FLuc apenas ocorrerá caso a sequência clonada a montante desta seja capaz de recrutar internamente o ribossoma, de forma independente da estrutura cap. Deste modo, conseguimos avaliar a capacidade de uma determinada sequência mediar a tradução pelo IRES, através da medição da respetiva atividade de luciferase. Em resultados anteriores do nosso laboratório, já tinha sido observado que a tradução da isoforma Δ160p53 mediada pelo IRES Δ160p53 era inibida na presença do elemento em estudo nesta tese. Tendo isto em conta, decidimos estudar este mecanismo em maior pormenor e tentar perceber como este funciona. Para avaliar a atividade dos respetivos IRES recorremos ao sistema bicistrónico, clonando a sequência dos IRES em estudo a montante da FLuc. As construções apenas com a sequência do IRES servem como controlo da atividade de cada IRES. Adicionalmente, clonámos a sequência do elemento inibidor a montante da sequência de cada IRES para avaliar a capacidade inibitória deste sobre cada IRES em estudo. Por último, fizemos construções com a sequência antissense (na direção 3’ para 5’) do elemento inibidor clonada a montante de cada IRES, de modo a obtermos um controlo da atividade do IRES mais semelhante ao elemento em avaliação. Utilizando estas construções foi possível observar uma diminuição significativa na atividade do IRES da isoforma Δ160p53, do c-Myc e do mTOR, em condições controlo e em condições de stresse induzidas pelo tratamento com etoposida, uma droga que induz quebras no DNA. Adicionalmente, de modo a compreendermos um pouco melhor a forma de atuação deste elemento inibidor sobre os IRES em estudo, o mesmo sistema bicistrónico com a sequência do IRES foi co-transfetado com construções monocistrónicas, com ou sem o elemento inibidor presente. Os resultados obtidos demonstraram uma diminuição significativa da atividade do IRES do c-Myc e da isoforma Δ160p53 quando estes foram co-transfetados com o elemento inibidor, indicando que possivelmente o elemento inibidor atua através de um mecanismo em trans no IRES do c-Myc e da isoforma Δ160p53. Estes resultados podem indicar uma nova forma de regulação da tradução mediada por IRES, que poderá ter funções importantes na regulação de proteínas, tal como o c-Myc e a isoforma Δ160p53, que estão normalmente desreguladas em cancro. Adicionalmente, a tese também teve como objetivo o estudo da tradução da isoforma Δ169p53 mediada pelo IRES Δ160p53, e avaliar o efeito de mutações missense do gene p53 na tradução desta isoforma. Utilizando o sistema bicistrónico anteriormente descrito, avaliámos a atividade do IRES Δ160p53 e o efeito de três das mutações missense no gene p53 mais comuns em cancro (R175H, R248Q e R273H) na tradução a partir do codão de iniciação 160 ou 169. Para tal, fizemos as mutações M160A (de metionina para arginina) e M169A em construções bicistrónicas com a sequência do IRES do Δ160p53 clonada, com e sem as mutações missense enumeradas anteriormente. Os resultados indicam que a tradução a partir do codão 169 também é mediada pelo IRES Δ160p53. Adicionalmente, sugerem que as duas isoformas, Δ160p53 e a Δ169p53, desempenham funções em diferentes condições celulares, sendo que a isoforma Δ169p53 desempenhará funções em condições fisiológicas, enquanto que a isoforma Δ160p53 desempenhará funções em condições de stress, nomeadamente em condições de stress do retículo endoplasmático. Mais estudos sobre as isoformas é de extrema importância, uma vez que quanto maior a compreensão sobre a expressão das isoformas do p53, mas fácil será a compreensão do seu papel em cancro.
Gene expression in eukaryotes is a complex and tightly regulated process that involves multiple interconnected steps. One of those is the messenger ribonucleic acid (mRNA) translation, the process of protein synthesis, which is a fundamental step for maintaining cell’s homeostasis. Under normal conditions, translation initiation of most mRNAs occurs via a 5’ cap-dependent scanning mechanism. This canonical mode of translation consists in the recruitment of the 40S ribosomal subunit and initiation factors to the 5’ cap structure, followed by 5’ untranslated region (UTR) scanning until the recognition of an initiation codon in a favorable context. However, under unfavorable or energy-depriving conditions canonical translation is compromised and the overall protein synthesis is reduced. Still, specific mRNAs, which encode proteins that are master regulators of cell responses, continue to be translated by alternative mechanisms. The internal ribosome entry site (IRES)-mediated translation is one of those alternatives, in which the 40S ribosome is directly recruited to the vicinity of the initiation codon. This mechanism relies on complex mRNA structures and can be assisted by some canonical factors and other auxiliary proteins, named IRES trans-acting factors (ITAFs). Interestingly, several proteins containing an IRES element in their mRNA are deregulated in cancer, suggesting an important role for IRES-mediated translation in cancer. One example is the tumor suppressor p53, an important transcription factor that ensures cellular homeostasis. The p53 gene is frequently mutated in human cancers, and most of its mutations are missense and often exhibit a gain-of-function phenotype, which confers oncogenic functions to p53. Over the years, at least fifteen isoforms p53 isoforms have been identified, which result from alternative splicing, alternative promoter usage or alternative initiation of translation. Two IRESs within p53 mRNA have been described, and our laboratory identified a third IRES element that regulates Δ160p53 isoform expression. Recently, we have associated mutant p53 “gain-of-function” cancer phenotype, such as enhanced cell survival, invasion, proliferation, and adhesion, with the expression of higher levels of shorter p53 isoforms, such as Δ160p53 isoform. Considering the above information, in this thesis we proposed to test the effect of a newly identified inhibitory element in p53 mRNA on the activity of different IRESs, namely IRESs present on mRNAs of oncogenic proteins, and to study its molecular mechanisms. To do that, we used a bicistronic system containing two reporter genes—Renilla luciferase (RLuc) and firefly luciferase (FLuc)—that are transcribed as a single bicistronic mRNA. RLuc is translated via cap-dependent translation and is the internal control, whereas FLuc is only translated if the sequence in study cloned upstream can promote its translation through cap-independent mechanisms. The obtained results demonstrate that the p53 mRNA inhibitory element significantly reduces the IRES activity of Δ160p53, C-Myc and mTOR, in normal and genotoxic culture conditions. Moreover, the results also suggest that the p53 mRNA inhibitory element act by a trans mechanism on c-Myc and Δ160p53 IRES. Additionally, in this thesis, we also proposed to assess the IRES-mediated translation of Δ169p53, a new shorter p53 isoform, and to investigate the impact of p53 missense cancer mutations (R175H, R248Q and R273H) in the expression of this isoform. Using the bicistronic system previously described, we were able to observe that Δ160p53 IRES also regulates the translation of ∆169p53 isoform, in addition to Δ160p53 isoform. Moreover, these two p53 isoforms seem to play a role in different cellular conditions, and the tested p53 missense cancer mutations seem to differently regulate the IRES-mediated translation of the studied isoforms. In conclusion, these results suggest a new possible mode of IRES-mediated translation regulation of specific mRNAs, and provide a deeper knowledge on p53 isoforms and its functions.
Gene expression in eukaryotes is a complex and tightly regulated process that involves multiple interconnected steps. One of those is the messenger ribonucleic acid (mRNA) translation, the process of protein synthesis, which is a fundamental step for maintaining cell’s homeostasis. Under normal conditions, translation initiation of most mRNAs occurs via a 5’ cap-dependent scanning mechanism. This canonical mode of translation consists in the recruitment of the 40S ribosomal subunit and initiation factors to the 5’ cap structure, followed by 5’ untranslated region (UTR) scanning until the recognition of an initiation codon in a favorable context. However, under unfavorable or energy-depriving conditions canonical translation is compromised and the overall protein synthesis is reduced. Still, specific mRNAs, which encode proteins that are master regulators of cell responses, continue to be translated by alternative mechanisms. The internal ribosome entry site (IRES)-mediated translation is one of those alternatives, in which the 40S ribosome is directly recruited to the vicinity of the initiation codon. This mechanism relies on complex mRNA structures and can be assisted by some canonical factors and other auxiliary proteins, named IRES trans-acting factors (ITAFs). Interestingly, several proteins containing an IRES element in their mRNA are deregulated in cancer, suggesting an important role for IRES-mediated translation in cancer. One example is the tumor suppressor p53, an important transcription factor that ensures cellular homeostasis. The p53 gene is frequently mutated in human cancers, and most of its mutations are missense and often exhibit a gain-of-function phenotype, which confers oncogenic functions to p53. Over the years, at least fifteen isoforms p53 isoforms have been identified, which result from alternative splicing, alternative promoter usage or alternative initiation of translation. Two IRESs within p53 mRNA have been described, and our laboratory identified a third IRES element that regulates Δ160p53 isoform expression. Recently, we have associated mutant p53 “gain-of-function” cancer phenotype, such as enhanced cell survival, invasion, proliferation, and adhesion, with the expression of higher levels of shorter p53 isoforms, such as Δ160p53 isoform. Considering the above information, in this thesis we proposed to test the effect of a newly identified inhibitory element in p53 mRNA on the activity of different IRESs, namely IRESs present on mRNAs of oncogenic proteins, and to study its molecular mechanisms. To do that, we used a bicistronic system containing two reporter genes—Renilla luciferase (RLuc) and firefly luciferase (FLuc)—that are transcribed as a single bicistronic mRNA. RLuc is translated via cap-dependent translation and is the internal control, whereas FLuc is only translated if the sequence in study cloned upstream can promote its translation through cap-independent mechanisms. The obtained results demonstrate that the p53 mRNA inhibitory element significantly reduces the IRES activity of Δ160p53, C-Myc and mTOR, in normal and genotoxic culture conditions. Moreover, the results also suggest that the p53 mRNA inhibitory element act by a trans mechanism on c-Myc and Δ160p53 IRES. Additionally, in this thesis, we also proposed to assess the IRES-mediated translation of Δ169p53, a new shorter p53 isoform, and to investigate the impact of p53 missense cancer mutations (R175H, R248Q and R273H) in the expression of this isoform. Using the bicistronic system previously described, we were able to observe that Δ160p53 IRES also regulates the translation of ∆169p53 isoform, in addition to Δ160p53 isoform. Moreover, these two p53 isoforms seem to play a role in different cellular conditions, and the tested p53 missense cancer mutations seem to differently regulate the IRES-mediated translation of the studied isoforms. In conclusion, these results suggest a new possible mode of IRES-mediated translation regulation of specific mRNAs, and provide a deeper knowledge on p53 isoforms and its functions.
Descrição
Tese de mestrado em Biologia Molecular e Genética, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2021
Palavras-chave
Locais de entrada internos do ribossoma (IRES) p53 Isoforma Δ160p53 Regulação da tradução por IRES Cancro Teses de mestrado - 2021