A carregar...
Publicação
Strategies of miR-124-3p Enrichment in Neuronal Exosomes and Reparative Effects in Human Tricultures Modeling Aging, Neurodegeneration, and Inflammation in Alzheimer’s Disease
| Nome: | Descrição: | Tamanho: | Formato: | |
|---|---|---|---|---|
| 3.55 MB | Adobe PDF |
Autores
Resumo(s)
A doença de Alzheimer (DA) é uma doença caracterizada por uma severa neurodegeneração e
neuroinflamação cronica que conduz, em grande parte, à demência. Como resultado, a memória, a
função cognitiva, o comportamento e as competências sociais deterioram-se gradualmente. Caracterizase pela morte das células cerebrais resultando numa atrofia do cérebro. É causada por uma acumulação
anormal de proteínas dentro e à volta das células cerebrais,sendo o peptídeo amiloide-β (Aβ) e a proteína
Tau fosforilada e total, os seus marcadores moleculares mais utilizados. A DA é fortemente influenciada
pela desregulação de microRNAs (miRNAs) e pela inflamação e reatividade associada à microglia.
Além disso, alguns estudos identificaram o papel da reatividade dos astrócitos na neuroprotecção,
plausivelmente na fase prodrómica da DA, ao secretar moléculas anti-inflamatórias, que eliminam a Aβ
e limitam a neuro- inflamação no sistema nervoso central (SNC). Contudo, também secretam alarminas
e mediadores inflamatórios que concorrem para desregular a homeostase e agravar o quadro
inflamatório. Apesar da patogenicidade da DA ter vindo a ser estudada há já muitos anos, e haver
bastante informação, as causas não se encontram esclarecidas e, por isso, a doença não tem cura à data
de hoje. Uma das dificuldades reside na utilização de modelos animais, que não partilham a
fisiopatologia da doença humana.
Os microRNAs (miRNAs) são pequenos RNAs não codificantes (~22 nucleótidos) que regulam
a expressão dos genes nas células ao se ligarem ao RNA mensageiro (mRNA), controlando desta forma
os níveis de expressão proteica durante a inflamação. Estes miRNAs têm sido recentemente estudados
como biomarcadores de diagnóstico e potenciais terapias para a DA. Os miRNAs participam ainda na
comunicação entre células, quer na forma livre, quer integrando o conteúdo dos exossomas, sendo
capazes de alterar a expressão de genes na célula recipiente e contribuir para a propagação da
neuroinflamação.
Os exossomas são pequenas vesículas com uma bicamada lipídica, contendo proteínas e material
genético, com diâmetro entre 30-150 nm, que são secretadas por todos os tipos celulares. De origem
endossómica, os exossomas são mediadores cruciais na comunicação entre células e entre tecidos. Uma
vez que podem atravessar a barreira hematoencefálica e entregar a sua carga às células alvo, nos últimos
anos tem havido um interesse crescente na sua utilização para o diagnóstico precoce de doenças
neurodegenerativas, devido ao seu conteúdo em proteínas mutantes e miRNAs associados à doença.
Além disso, os exossomas têm a capacidade de se manterem estáveis na circulação periférica,
características que os tornam sistemas atraentes como veículos de moléculas para tratamento de doenças
neurodegenerativas, como a DA.
Este estudo tem como um dos principais objetivos a produção de exossomas com conteúdo
elevado em miR-124, com o objetivo de ser utilizado como estratégia terapêutica, sempre que o doente
manifeste uma redução da sua expressão. Trabalhos antes realizados no nosso laboratório evidenciaram
que uma diminuição de miR-124 nos neurónios se encontra associado à perda de espinhas dendríticas e
comprometimento sináptico, bem como a uma elevação da proteína precursora do Aβ, pelo que a sua
regulação poderá ser crucial para impedir ou atrasar a progressão da DA. Para tal, o outro objetivo
pretende a otimização de um modelo humano de triculturas de células neuronais, capaz de reproduzir
alguns dos mecanismos de patogenicidade da DA, para servir de modelo no estudo da eficácia dos
exossomas potencialmente terapêuticos. De salientar que este modelo pode também ser aplicado ao
estudo dos subtipos da doença a partir dos fibroblastos dos doentes DA e produção de células induzidas
pluripotentes, capazes de se diferenciar em neurónios, microglia e astrócitos.
Com estes objetivos em mente, servimo-nos de dois processos de enriquecimento do miR-124 em
exossomas. Um, o de fazer uma transfeção do miRNA-124-3p exógeno, sintetizado (mimico), em
células de neuroblastoma humano SH-SY5Y e recolher os exossomas enriquecidos em miR-124
(CT124). O outro o de transfetar diretamente os exossomas isolados das células de neuroblastoma humano SH-SY5Y usando Exo-FectTM (ET124). A sua eficácia foi depois testada em microglia isolada
do córtex de ratinhos aos 2 dias de vida e cultivada por dois dias em cultura, condição na qual se observa
vários marcadores de ativação devido ao stresse produzido pelo método de isolamento. A avaliação
baseou-se na expressão microglial em miR-124, número de exossomas internalizados e marcadores de
ativação microglial. Ambos os estudos evidenciaram uma eficiente captação de exossomas pela
microglia, juntamente com uma entrega mais eficiente do miR-124-3p. No entanto, selecionámos os
ET124 como o melhor método para recuperar o fenótipo homeostático da microglia (mais arginase 1 e
TREM2 (receptor desencadeador expresso nas células mielóides tipo 2), menos IBA1 (molécula
adaptadora ligante de cálcio ionizado-1) e mais P2RY12 (recetor purinérgico P2Y12), provavelmente
por serem preferencialmente captados pela microglia quando comparados com os CT124. Com o fim de
reproduzir um modelo de cultura de células neurais in vitro capaz de reproduzir a patologia de AD para
avaliar o poder reparador dos ET124, fomos otimizar a realização de triculturas
(neurónios+astrócitos+microglia) em sistemas microfluídicos tri-compartimentados que nos foram
providenciados pelo Dr. Alessandro Polini da CNR NANOTEC de Lecce, Itália. Estes sistemas apenas
viabilizam a sinalização parácrina entre as células, incluindo a distribuição de exossomas entre os 3
compartimentos contendo aqueles tipos celulares. A experiência envolveu a realização de estudos
controlo com uma primeira chip (Peter S. Staats) contendo SH-SY5Y (células humanas de
neuroblastoma como neurónios) /IM-HA (astrócitos humanos imortalizados) /CHME3 (linha microglial
humana). Aqui verificámos que a proporção 5:3:2 de neurónios/astrócitos/microglia e o uso de poli-Dlisina + laminina era o mais adequado para manter a viabilidade dos 3 tipos celulares. Uma segunda chip
para mimetizar o AD e o envelhecimento celular (Peter S. Staats) usando a estimulação com H2O2 e as
células SH-SY5Y transfetadas com a mutação SWEdish APP695 em tricultura, SH-SY5Y APPSWE/IMHA/CHME3. Uma terceira chip (Peter S. Staats) igual à segunda, mas onde foram adicionados os ET124.
Seguidamente, e focando no modelo da chip 2, foi possível verificar uma redução das neurites,
um aumento do TNFα (fator de necrose tumoral) e uma diminuição da sinaptofisina (proteína présináptica) e da PSD95 (proteína pós-sináptica de 95 kDA) nas células SH-SY5Y APPSWE, concordando
com a presença de inflamação e alterações sinápticas que caracterizam a DA. Em conformidade,
encontrámos também modificações na morfologia da microglia com uma redução acentuada da TREM2
e elevação de MHCII (complexo principal de histocompatibilidade classe II), de Arginase 1 e de S100B
(proteína ligante de cálcio da família S100). Do mesmo modo encontrámos modificações características
da reatividade dos astrócitos em AD, com o aumento da circularidade e perímetro da célula, bem como
de S100B, RAGE (recetor para produtos finais de glicação avançada), GFAP (proteína ácida fibrilar
glial) e Cx-43 (conexina 43), bem como diminuição de miR-124, miR-146a e miR-125b. As alterações
encontradas nestes dois tipos de células gliais valida o modelo de triculturas em sistema microfluídico
para estudo dos mecanismos de patogenicidade em AD.
Desta forma e continuando o estudo com a adição de ET124 (chip 3), o nosso objetivo seguinte
foi de testar o seu papel reparador nas triculturas que evidenciaram neurodegeneração e inflamação.
Pudemos comprovar que impediu a atrofia das neurites no sistema AD (SWE+H2O2), diminuiu a nNOS
(óxido nítrico sintase neuronal) e aumentou o S100B e o miR-21, para além de reduzir ligeiramente o
défice em proteínas sinápticas e aumentar um pouco o miR-124. Para além destes benefícios nos
neurónios, também aumentou o perímetro e reduziu a circularidade microglial, contrariando o aumento
de S100B e a redução do P2RY12 e de TREM2, favorecendo a capacidade fagocítica, em paralelo com
um aumento do miR-124, que comprova a captação dos ET124 pela microglia e modificações para um
fenótipo mais homeostático. Finalmente, os resultados apontam que o tratamento é eficaz na prevenção
da reatividade do astrócito, contrariando o aumento de circularidade e reduzindo os níveis de marcadores
como o S100B, também um pouco o GFAP, Cx43 e RAGE. Também aqui encontrámos um efeito
notório no aumento, não só do miR-124 (o que era também pretendido) mas também de miR-146a e miR-125b, juntamente com a diminuição de miR-21 e miR-155, justificando o seu papel na regulação
do papel regulador dos astrócitos na neurodegeneração e inflamação.
Em suma, o nosso sistema microfluídico de tricultura baseado em células humanas SHSY5YSWE/IM-HA /CHME3 estimuladas com H2O2 mostrou ser muito dinâmico e reproduzir muitas
características da neurodegeneração e inflamação associadas à DA, sendo uma boa ferramenta para
identificar subtipos da doença e testar novas estratégias terapêuticas. Um exemplo disso é o facto dos
nossos ET124 revelarem ser uma terapêutica neuroprotetora promissora ao contrariar a disfunção
sináptica a ativação da microglia e a reatividade do astrócito, graças à sua capacidade única de modular
a resposta imunológica em contexto de DA, embora sejam necessários mais estudos antes da sua
aplicação na clínica.
Alzheimer’s disease (AD) is a major public health threat, characterized by severe neurodegeneration and chronic neuroinflammation, without effective treatment. Cellular and exosomal microRNA (miRNA) abnormalities are key in the AD onset and progression and may serve as therapeutic targets. Literature reports miRNA(miR)-124-3p as being both upregulated and downregulated in AD. Our previous data using human SH-SY5Y-APP695 SWEdish neuroblastoma cells (SWE) showed that miR-124-3p regulate dendritic spines, APP expression, toxic amyloid species, and Tau phosphorylation. We additionally showed that exosomal miR-124 was able to modulate IFNγmicroglia activation. Our goals in this thesis were to generate exosomes enriched in miR-124 and to test their therapeutic potential in an optimized human triculture model of neurons/astrocytes/microglia cell lines in a microfluidic device, for preventing AD-associated neurodegeneration and inflammation. Exosomes from SH-SY5Y cells were characterized for size, number, and protein content. miR124-engineered exosomes were produced from SH-SY5Y cells transfected with miR-124 mimic (CT124) or by direct transfection in exosomes using Exo-FectTM (ET124). ET124 was more efficient than CT124 in delivering miR-124-3p to activated microglia and in recovering their homeostatic phenotype. The optimized human AD tricultures, used H2O2-stressed SH-SWE/astrocytes/microglia in a microfluidic device. Reduction of neurites/synaptic proteins were observed in SH-SWE cells, together with elevated inflammatory mediators/miRNAs, mainly in microglia and astrocytes showing morphological alterations. Increase of MHCII/S100B and reduction of TREM2/P2RY12 in microglia, plus the increase of S100B/RAGE and decrease of miR-124/miR-146a/miR-125b in astrocytes, validated the AD model. Addition of ET124 prevented neurite atrophy, reverted cell dysmorphologies, and mitigated S100B levels in glial cells. Transcriptionally, ET124 rectified nNOS/S100B deregulation in SH-SY5Y cells, boosted microglial TREM2, and compensated the reactive inflammatory gene/miRNA profile in astrocytes. In sum, ET124 represents a versatile and effective therapeutic approach to modulate the neuronglia immune response in AD. The triculture model lays the foundation for further investigations toward AD treatment.
Alzheimer’s disease (AD) is a major public health threat, characterized by severe neurodegeneration and chronic neuroinflammation, without effective treatment. Cellular and exosomal microRNA (miRNA) abnormalities are key in the AD onset and progression and may serve as therapeutic targets. Literature reports miRNA(miR)-124-3p as being both upregulated and downregulated in AD. Our previous data using human SH-SY5Y-APP695 SWEdish neuroblastoma cells (SWE) showed that miR-124-3p regulate dendritic spines, APP expression, toxic amyloid species, and Tau phosphorylation. We additionally showed that exosomal miR-124 was able to modulate IFNγmicroglia activation. Our goals in this thesis were to generate exosomes enriched in miR-124 and to test their therapeutic potential in an optimized human triculture model of neurons/astrocytes/microglia cell lines in a microfluidic device, for preventing AD-associated neurodegeneration and inflammation. Exosomes from SH-SY5Y cells were characterized for size, number, and protein content. miR124-engineered exosomes were produced from SH-SY5Y cells transfected with miR-124 mimic (CT124) or by direct transfection in exosomes using Exo-FectTM (ET124). ET124 was more efficient than CT124 in delivering miR-124-3p to activated microglia and in recovering their homeostatic phenotype. The optimized human AD tricultures, used H2O2-stressed SH-SWE/astrocytes/microglia in a microfluidic device. Reduction of neurites/synaptic proteins were observed in SH-SWE cells, together with elevated inflammatory mediators/miRNAs, mainly in microglia and astrocytes showing morphological alterations. Increase of MHCII/S100B and reduction of TREM2/P2RY12 in microglia, plus the increase of S100B/RAGE and decrease of miR-124/miR-146a/miR-125b in astrocytes, validated the AD model. Addition of ET124 prevented neurite atrophy, reverted cell dysmorphologies, and mitigated S100B levels in glial cells. Transcriptionally, ET124 rectified nNOS/S100B deregulation in SH-SY5Y cells, boosted microglial TREM2, and compensated the reactive inflammatory gene/miRNA profile in astrocytes. In sum, ET124 represents a versatile and effective therapeutic approach to modulate the neuronglia immune response in AD. The triculture model lays the foundation for further investigations toward AD treatment.
Descrição
Tese de Mestrado, Bioquímica e Biomedicina, 2024, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências
Palavras-chave
Modelo de doença de Alzheimer Exossomas neuronais Sistema microfluídico Transfeção com miR-124-3p mimico Tricultura de células neurais humanas Teses de mestrado - 2024