Exploring silicone functionalization with surfactins towards the improvement of medical devices antimicrobial properties

Lourenço, Madalena Gonçalves

http://hdl.handle.net/10451/63030

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Authors

Lourenço, Madalena Gonçalves

Advisor(s)

Silva, Isabel Alexandra Caldeira Ribeiro Monge da

Duarte, Noélia Maria da Silva Dias

Abstract(s)

O uso recorrente de antibióticos, seja em ambiente hospitalar, na alimentação animal, ou mesmo na agricultura, tem desencadeado resistência bacteriana e levado a dificuldades na prevenção e tratamento de infeções bacterianas (1,2). Segundo a Organização Mundial da Saúde (OMS), mais de 50% das infeções bacterianas, que podem levar à morte, estão associadas ao desenvolvimento de resistências, colocando assim a população em perigo (3). As infeções associadas aos cuidados de saúde (IACs) são a principal causa de morte evitável em doentes hospitalizados, sendo um problema alarmante nos dias de hoje. Dentro destas é possível destacar as infeções relacionadas com o uso de dispositivos médicos que embora salvem muitas vidas possuem superfícies propicias à colonização por microrganismos. Considerando os dados relatados, os estudos atuais devem focar-se em estratégias eficazes para prevenir a colonização das superfícies dos dispositivos médicos, a fim de evitar infeções por bactérias altamente resistentes ou mesmo multirresistentes. Diferentes estratégias têm vindo a ser desenvolvidas para melhorar as propriedades antimicrobianas dos dispositivos médicos, evitando a adesão de microrganismos e novas infeções. Estas estratégias podem ser passivas, repelindo bactérias através de modificações físicas ou químicas, por exemplo, modificando a hidrofilia das superfícies, ou abordagens ativas, que revestem superfícies com agentes antimicrobianos capazes de interferir com as células microbianas. Têm sido sugeridos revestimentos que e incluem a libertação de agentes antibacterianos (e.g., antibióticos, antissépticos, óxido nítrico e prata), estratégias de morte por contacto (e.g., compostos amónio quaternário, quitosano, peptídos antimicrobianos e enzimas) ou estratégias anti adesivas (4,5). Os biotensioativos (BT) podem ser uma alternativa interessante nesta temática uma vez que são biocompatíveis, biodegradáveis e pouco tóxicos, apresentam diferentes aplicações ambientais e atividade antimicrobianas (6,7). O principal objetivo deste trabalho é o desenvolvimento de um novo biomaterial revestido com BT, indicado para a utilização como cateteres médicos que seja eficaz contra a formação de biofilmes. Neste trabalho é apresentado o uso de BT como potenciais agentes antimicrobianos contra a Staphylococcus aureus. O primeiro passo foi realizar a produção de soforolípidos (SLs) pela levedura Starmerella bombicola e da surfactina (SF) pela pela bactéria Bacillus subtilis. Os SLs foram produzidos em meio GPY suplementado com ácido oleico, obtendo-se um rendimento médio de 11,07  0,59 g/L. Para a produção de SF foram testados três meios de cultura diferentes, suplementados ou não com Mn2+, tendo as produções terminado ao fim de 72h ou 144h. Verificou-se que o rendimento foi superior (0,69 ± 0,09 g/L) quando se usou o meio MSM não suplementado com Mn2+ ao fim de 72 h. A caracterização dos BT produzidos foi realizada por cromatografia em camada fina (TLC) e cromatografia líquida de alta eficiência acoplada à espectrometria de massa (HPLC-MS). A mistura de SLs obtida apresentou na sua composição SLs acídicos (C18:1 de, mono e di-acetilados) e lactónicos (C16:0 diacetilado, C18:0 diacetilado, C18:1 mono e diacetilado e C18:2 diacetilado). A análise das amostras da produção de SF revelou a existência de cinco congéneres de surfactina e também iturina (um BT da mesma família). Os congéneres de iturina apresentaram um tempo de retenção entre os 14,86 min e 16,42 min, com m/z [M+H]+ 1030, 1044, 1058, 1072 e 1086. Os congéneres de surfactina apresentaram um tempo de retenção entre 34,24 min e 47,80 min, sendo possível identificar o congénere C12 com m/z 995 [M+H]+ e 1017 [M+Na]+, o congénere C13 com m/z 1009 [M+H]+ e 1031 [M+Na]+, o congénere C14 com m/z 1023 [M+H]+ e 1045 [M+Na]+, o congénere C15 com m/z 1037 [M+H]+ e 1059 [M+Na]+ e por fim, o congénere C16 com m/z 1051 [M+H]+ e 1073 [M+Na]+. Através do cromatograma do ião extraído foi possível concluir que o congénere C15 é o mais característico nas amostras de SF. Para além disso, também foi possível verificar que a surfactina é produzida em maior quantidade que a iturina. Foi possível identificar um padrão de fragmentação para surfactina e iturina identificando fragmentos alifáticos e peptídicos. Pela análise HPLC-MS dos produtos eluídos na análise por cromatografia em camada fina foi possível observar que quer a SF quer a iturina estão presentes nas três manchas obtidas na TLC. Foi ainda utilizado um método de extração em fase sólida com o objetivo de separar os dois BS lipopeptídos presentes nas amostras, onde se verificou a possibilidade de separar as impurezas iniciais da amostra e obter a surfactina pura. Com o objetivo de melhorar as propriedades antimicrobianas de silicone de grau médico realizou-se a funcionalização da superfície por ligação covalente às moléculas de SF produzidas. Esta ligação covalente foi conseguida através de uma série de etapas. Primeiramente, a superfície do silicone é oxidada com uma “solução piranha” (H2SO4/H2O2) e ligada ao (3-Aminopropil)trietoxissilano (APTES). A SF ativada (com EDC e NHS) é por fim ligada através do grupo COOH ao grupo NH2 da superfície (conferido pelo APTES). Espera-se que a SF seja ligada covalentemente à superfície do silicone utilizando apenas um dos ácidos carboxílicos livres; deixando o outro grupo COOH livre para uma nova ligação amida. Desta forma, foi realizada uma tentativa para adicionar uma carga positiva à SF, a fim de aumentar a sua interação com as membranas celulares dos microrganismos. Para este efeito, o grupo COOH foi ativado com uma solução de EDC e NHS para poder reagir com o composto 4-dimetilaminobutilamina, apresentando uma amina terciária terminal, podendo assim sofrer uma reação de metilação. Esta estratégia teve como objetivo a repulsão e/ou morte de agentes patogénicos, através de interações físico-químicas ou por contato, respetivamente. Por fim, foi abordada uma outra estratégia realizando um revestimento adicional de SLs ao silicone funcionalizado com SF através de adsorção. Esta última estratégia adiciona à primeira uma abordagem de libertação de compostos antimicrobianos. Assim, foram efetuados três tipos de funcionalização: silicone funcionalizado com SF (SSF), silicone funcionalizado com derivado de surfactina carregado positivamente (SSF+) e silicone funcionalizado com SF e SLs adsorvidos (SSF+SLs). A caracterização das superfícies funcionalizadas foi efetuada através da avaliação do ângulo de contacto (i.e., molhabilidade da superfície) e por espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier (FTIR) com reflexão total atenuada (ATR). Os resultados demostraram uma diminuição significativa do ângulo de contato nas amostras funcionalizadas comparativamente ao controlo, indicando alterações na superfície do silicone. Obteve-se um ângulo de contacto de 72,72  1,03º para o controlo, 39,53  5,59º para a amostra SSF, 52,41  5,60º para a amostra SSF+ e por fim, 10,87  1,35º para a amostra SSF+SLs ao fim de 5 min. O revestimento do silicone com SLs foi comprovado por FTIR-ATR, exibindo bandas características dos grupos funcionais do biotensioativo e do silicone. Para atingir o objetivo final do trabalho, foi avaliada a atividade antibiofilme das amostras funcionalizadas contra S. aureus. Através da contagem de unidades formadoras de colónias (UFC), os resultados demonstraram uma redução de 1 log para as amostras SSF+, 0,5 log para SSF e 0,2 para SSF+SLs. Para além disso, quantidade de células bacterianas aderidas às amostras funcionalizadas comparativamente ao silicone não tratado foi avaliada por microscopia eletrónica de varrimento (MEV). Em resumo, neste trabalho realizou-se a produção, caracterização e funcionalização de biotensioativos, especificamente surfactina e soforolípidos, em superfícies de silicone de grau médico para prevenir a formação de biofilmes de S. aureus, sendo a amostra SFF+ a que demonstrou maior sucesso na redução do biofilme. Este trabalho demonstra mais uma vez que os biotensioativos podem representar uma abordagem muito importante na prevenção da formação de biofilme em superfícies de dispositivos médicos e infeções relacionadas com estes.

Medical devices-related infections are an emergent burden and preventive strategies are a demand. The improvement of the antimicrobial properties of biomaterials surfaces has been tested, functionalization with different antimicrobials and antimicrobial biosurfactants might be a suitable alternative. This work aims at the development of a new coated/functionalized biomaterial with surfactins intended for medical catheters production and effective against biofilm formation. Thus, the use of biosurfactants (BS) as antimicrobial agents for the functionalization of silicone surfaces was explored. Surfactins was produced by Bacillus subtilis, in MSM medium, presenting a yield of 0.69 ± 0.09 g/L, while SLs were produced by Starmerella bombicola, in GPY medium added of oleic acid, with a yield of 11.07 ± 0.59 g/L. The biosurfactants were characterized trough TLC and HPLC-MS. Surfactins was identified as a set of five congeners by mass spectrometry namely, C12 m/z 995 [M+H]+, C13 m/z 1009 [M+H]+, C14 m/z 1023 [M+H]+, C15 m/z 1037 [M+H]+, and C16 m/z 1051 [M+H]+. Iturin was also identified as a mixture of five congeners with m/z [M+H]+ 1030, 1044, 1058, 1072 and 1086. Solid phase extraction was selected as separative method and it was possible to separate initial impurities and surfactins from iturin. For silicone functionalization with surfactins the biomaterial surface was first oxidized, treated with APTES and then covalently bonded with previously activated surfactins (i.e., with EDC and NHS). Achieved surfaces were also covered with sophorolipids or submitted to a reaction with 4-dimethylaminobutylamine followed by a methylation reaction to obtain a positively charged surface. Surfaces functionalization was confirmed by surface wettability and FTIR-ATR analysis while antibiofilm activity was assessed by colony forming units count and SEM analysis. The antibiofilm activity showed a reduction of 1 log for the SSF+ samples, 0.5 log for the SSF samples and 0.2 for the SSF+SLs samples. This work highlights the need for continuous research on the prevention of medical devices-related infections, namely vascular medical catheters.