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Publicação
Translational research of regulatory T-cells within clinical studies
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Resumo(s)
Regulatory T cells (Tregs) are essential elements of a healthy immune system. They comprise 5-10% of the peripheral blood CD4 T cell compartment in healthy individuals and play a critical role in protecting their host against immunopathological damage following inflammatory or immunological challenges. Tregs are composed of heterogeneous subsets that together can suppress a wide range of effector cell types through several mechanisms. Humans have since birth Treg maturation and phenotypic heterogeneity, which increases during our childhood. The Treg capacity to suppress effector cells allows transplantation tolerance, and when this careful balance is disturbed, it can lead to graft-versus-host disease (GVHD). Treg heterogeneity also rapidly increases after hematopoietic stem cell transplantation (HSCT). However, a precise and coordinated balance between several immune cells is required to prevent transplant rejection. Patients with GVHD not only have fewer Treg cells but also fewer Treg subpopulations and higher activation of effector cells.
Two newer possible ways to treat GVHD, are with low-dose interleukin 2 (IL-2) or with antibodies conjugated to an immunotoxin (CD3/CD7-ricin A). Low-dose IL-2 therapy selectively induces the expansion of Tregs, improving the clinical manifestations of chronic GVHD. It promotes Treg homeostasis without activating effector cells.
The anti-CD3/CD7-ricin A therapy, which mostly depletes T and natural killer cells, has an overall response rate of 60%, with 50% achieving a complete response. The 6-month overall survival rate is 60%. After the profound depletion caused by the treatment, the immune system recovers with a diverse T cell repertoire leading to the transplant tolerance.
The profound but highly selective immunologic effects of both therapies in promoting immune tolerance may be used in a wide variety of clinical settings. Furthermore, the translational research methodology developed can be reapplied in future clinical studies, unveiling the defects that contribute to other immune dysfunctions.
Chapter 1 contains a general introduction. We start by defining Treg cells and explaining how these cells are essential for maintaining tolerance and preserving the immune system's homeostasis. Then, we analyzed the relationship between Treg cells and HSCT. Tregs have the ability to mediate transplant tolerance and, when this careful balance is disturbed, it can trigger GVHD. The imbalance between effector and regulatory T cells that occurs during GVHD is explored in detail. In addition, we highlight the relevance of low-dose IL-2 therapy for patients with GVHD and how the therapy positively recovers the Treg population. Finally, we briefly describe the main objectives of this thesis. In chapter 2 we specify the aims and outline of this thesis.
In chapter 3, we investigated the diversity of the Treg cell compartment in newborns, healthy adults, during the 2-year period after HSCT and in patients suffering from chronic GVHD. We have shown that adults have significantly higher amounts of Tregs in their blood than those present in umbilical cord blood (CB), but they also have additional functional and memory subpopulations of Tregs that are not present in CB. The number of subpopulations of functional and memory Tregs expands from birth to adulthood. As for patients after HSCT, the memory Treg subpopulation repertoire is already present after transplantation, while the diversity of Treg cells still expands within the 2-year post-transplant. GVHD patients present significantly fewer distinct subpopulations of functional Tregs, proposing a correlation between the lack of heterogeneity of Tregs and chronic GVHD.
In chapter 4, we demonstrated that low-dose IL-2 therapy selectively induces the expansion of CD4 Tregs and improves the clinical manifestations of chronic GVHD. Using mass cytometry, we demonstrated in chapter 4 that low concentrations of IL-2 selectively induce STAT5 phosphorylation in Helios CD4 Tregs cells and CD56bright CD16– NK cells in vitro and in vivo. The effects of low-dose IL-2 therapy on conventional CD4 T cells and CD8 T cells were limited to increased expression of PD-1 in memory effector T cells. The selective effects of low-dose IL-2 therapy on Helios CD4 Tregs cells and NK CD56bright cells induce the constitutive expression of high-affinity IL-2 receptors.
Recognizing that we urgently need more effective therapies for the treatment of patients with steroid-refractory acute graft-versus-host-disease (SR-aGVHD), we describe, in chapter 5, a phase I / II clinical trial that examines the safety and effectiveness of a new biological therapy for (SR-aGVHD). A combination of anti-CD3 and anti-CD7 antibodies separately conjugated to recombinant ricin A (CD3/CD7–1T). This induces in vivo depletion of T cells and NK cells, and suppresses the activation of the cellular receptor in T cells. On the 28th day after the initiation of therapy with CD3/CD7-IT, the overall response rate was 60%, with 50% reaching a complete response. The overall 6-month survival rate was 60%. The treatment, which was administered for 1 week, caused profound but transient depletion of T cells and NK cells, followed by rapid recovery of the immune system with a diverse repertoire of T cells and preservation of specific T cells capable of identifying Epstein-Barr virus and cytomegalovirus. Treatment with CD3/CD7- IT was safe and well tolerated by patients, with a relatively low prevalence of adverse events, such as hypoalbuminemia, microangiopathy and thrombocytopenia, which were controllable and reversible.
Finally, we were interested in testing the same mass cytometry panel used in chapter 3, to study Treg cells in other circumstances of immune disorder, unrelated to HSCT. In chapter 6, we evaluated idelalisib as a first-line therapy for the treatment of chronic lymphocytic leukemia (CLL) relapse. After a follow-up period of 14.7 months (on average), hepatotoxicity was considered a frequent and often serious adverse event. Several lines of evidence suggest that this hepatotoxicity was immune-mediated. A lymphocytic infiltrate was seen in liver biopsy samples taken from 2 individuals with transaminitis, and the levels of pro-inflammatory cytokines CCL-3 and CCL-4 were higher in individuals with hepatotoxicity. A decrease in peripheral blood regulatory T cells was observed in patients who suffered from hepatotoxicity during therapy, which is consistent with an imune-mediated mechanism.
In chapter 7 we conclude this thesis by summarizing and discussing the results.
As células T reguladoras (Tregs) são essenciais para manter um sistema imunológico saudável. Estas células compõem 5-10% das células CD4 no sangue periférico de indivíduos saudáveis e desempenham um papel crítico na proteção do indivíduo contra danos imunopatológicos após desafios inflamatórios ou imunológicos. Tregs são compostas por sub-populações heterogêneas que, juntas podem suprimir uma ampla gama de células efetoras por meio de vários mecanismos. Os seres humanos apresentam desde o nascimento uma ampla heterogeneidade fenotípica de Tregs, que aumenta durante a infância. A capacidade das Treg de suprimir as células efetoras permite ao organismo tolerar transplantes e, quando esse equilíbrio cuidadoso é perturbado, pode levar à doença do enxerto contra o hospedeiro (DECH). A heterogeneidade das Tregs também aumenta rapidamente após o transplante de células-tronco hematopoiéticas (TCTH). No entanto, um equilíbrio preciso e coordenado entre várias células do sistema imunológico é necessário para prevenir a rejeição do transplante. Pacientes com DECH, não têm apenas menos células Treg, mas também menos subpopulações de Tregs e maior ativação de células efetoras. Dois novos tratamentos contra a DECH são a administração de interleucina 2 (IL-2) em dose-baixa ou através de anticorpos conjugados a uma imunotoxina (CD3 / CD7-ricina A). A terapia com dose-baixa de IL-2 induz seletivamente a expansão das Tregs, melhorando as manifestações clínicas da DECH crônica. Esta também promove a homeostase de Treg sem ativar células efetoras. A terapia anti-CD3 / CD7-ricina A, que reduz principalmente as células T e natural killer (NK), tem uma taxa de resposta geral de 60%, com 50% dos doentes atingindo uma resposta completa. A taxa de sobrevivência global em 6 meses é de 60%. Após a eliminação de células efetoras, o sistema imunológico recupera com um repertório de células T diverso, permitindo a tolerância do transplante. Os efeitos imunológicos selectivos e profundos de ambas as terapias na promoção da tolerância imunológica, podem ser usados numa ampla variedade de situações clínicas. Além disso, a metodologia de pesquisa translacional desenvolvida pode ser reaplicada em estudos clínicos futuros. No capítulo 1, encontra-se a introdução geral. Começamos pela definição das células Tregs e explicação de como essas células são essenciais para manter a tolerância e preservação da homeostase do sistema imunológico. Em seguida, analisamos a relação entre as células Treg e o TCTH. Tregs têm a capacidade de mediar a tolerância ao transplante e, quando esse equilíbrio cuidadoso é perturbado, pode desencadear DECH. O desequilíbrio entre as células T efetoras e reguladoras que ocorre durante o DECH é explorado em detalhe. Além disso, destacamos a relevância da terapia de IL-2 em dose-baixa para pacientes com DECH e como a terapia recupera positivamente a população de Tregs. Por fim, descrevemos resumidamente os principais objetivos desta tese. No capítulo elaboramos sobre os objetivos e conteúdo da tese. No capítulo 3, investigamos a diversidade do compartimento das células Treg em recém- nascidos, adultos saudáveis, durante o período de 2 anos após TCTH e em pacientes que sofrem de DECH crónica. Mostramos que os adultos têm quantidades significativamente superiores de Tregs no sangue do que aquelas presentes no sangue do cordão umbilical (CU), mas também têm subpopulações funcionais e de memória adicionais de Tregs que não estão presentes em CU. A quantidade de subpopulações de Tregs funcionais e de memória expande-se do nascimento até à idade adulta. Quanto aos pacientes após TCTH, o repertório subpopulações Treg de memória já se encontra presente após o transplante, enquanto a diversidade de células Treg ainda se expande dentro do período de 2 anos pós- transplante. Os pacientes com DECH demonstram significativamente menos subpopulações distintas de Tregs funcionais, propondo uma correlação entre a falta de heterogeneidade de Tregs com a DECH crónica. No capítulo 4, demonstramos que a terapia com IL-2 em dose-baixa induz seletivamente a expansão de CD4 Tregs e melhora as manifestações clínicas da DECH crónica. Usando citometria de massa, demonstramos no capítulo 4 que baixas concentrações de IL-2 induzem seletivamente a fosforilação de STAT5 em células Helios CD4Tregs e células CD56bright CD16– NK in vitro e in vivo. Os efeitos da terapia de IL-2 em dose-baixa em células T CD4 convencionais e células T CD8 foram limitados ao aumento da expressão de PD-1 em células T efetoras de memória. Os efeitos seletivos da terapia IL-2 em dose- baixa nas células Helios CD4 Tregs e células NK CD56bright induzem a expressão constitutivamente de receptores de IL-2 de alta afinidade. Reconhecendo que precisamos urgentemente de terapias mais eficazes para o tratamento de pacientes com doença aguda do enxerto contra hospedeiro, que não reage a esteróides (RE-aDECH) descrevemos, no capítulo 5, um ensaio clínico de fase I / II que examina a segurança e eficácia de uma nova terapia biológica para RE-aDECH. Uma combinação de anticorpos anti-CD3 e anti-CD7 separadamente conjugados com uma imunotoxina, a ricina A recombinante (CD3 / CD7-IT). Esta induz a depleção in vivo de células T e células NK, e suprime a ativação do receptor celular em células T. No dia 28 após o início da terapia com CD3 / CD7-IT, a taxa geral de resposta foi de 60%, com 50% atingindo uma resposta completa. A taxa de sobrevida global em 6 meses foi de 60%. O tratamento, que foi administrado durante 1 semana, causou depleção profunda, mas transitória de células T e células NK, seguido por rápida recuperação do sistema imunológico com um repertório diverso de células T e preservação de células T específicas capazes de identificar o vírus Epstein-Barr e citomegalovírus. O tratamento com CD3 / CD7-IT foi seguro e bem tolerado pelos doentes, com uma prevalência relativamente baixa de eventos adversos, os quais foram controláveis e reversíveis, como por exemplo hipoalbuminemia, microangiopática e trombocitopenia. Por último, estávamos interessados em testar o mesmo painel de citometria de massa usado no capítulo 3, para estudar as células Treg em outras circunstâncias de distúrbio imunológico, não relacionadas ao TCTH. No capítulo 6, avaliamos o idelalisib como terapia de primeira linha para o tratamento da recidiva leucemia linfocítica crónica (LLC). Após um período de acompanhamento de 14,7 meses (em média), a hepatotoxicidade foi considerada um evento adverso frequente e frequentemente grave. Várias linhas de evidência sugerem que essa hepatotoxicidade foi imuno-mediada. Um infiltrado linfocítico foi visto em amostras de biópsia hepática retiradas de 2 indivíduos com transaminase, e os níveis das citocinas pró-inflamatórias CCL-3 e CCL-4 foram maiores em indivíduos com hepatotoxicidade. Uma diminuição nas células T reguladoras do sangue periférico foi observada em pacientes que sofreram de hepatotoxicidade durante a terapia, o que é consistente com um mecanismo imunomediado. No capítulo 7 concluímos esta tese resumindo e discutindo os resultados.
As células T reguladoras (Tregs) são essenciais para manter um sistema imunológico saudável. Estas células compõem 5-10% das células CD4 no sangue periférico de indivíduos saudáveis e desempenham um papel crítico na proteção do indivíduo contra danos imunopatológicos após desafios inflamatórios ou imunológicos. Tregs são compostas por sub-populações heterogêneas que, juntas podem suprimir uma ampla gama de células efetoras por meio de vários mecanismos. Os seres humanos apresentam desde o nascimento uma ampla heterogeneidade fenotípica de Tregs, que aumenta durante a infância. A capacidade das Treg de suprimir as células efetoras permite ao organismo tolerar transplantes e, quando esse equilíbrio cuidadoso é perturbado, pode levar à doença do enxerto contra o hospedeiro (DECH). A heterogeneidade das Tregs também aumenta rapidamente após o transplante de células-tronco hematopoiéticas (TCTH). No entanto, um equilíbrio preciso e coordenado entre várias células do sistema imunológico é necessário para prevenir a rejeição do transplante. Pacientes com DECH, não têm apenas menos células Treg, mas também menos subpopulações de Tregs e maior ativação de células efetoras. Dois novos tratamentos contra a DECH são a administração de interleucina 2 (IL-2) em dose-baixa ou através de anticorpos conjugados a uma imunotoxina (CD3 / CD7-ricina A). A terapia com dose-baixa de IL-2 induz seletivamente a expansão das Tregs, melhorando as manifestações clínicas da DECH crônica. Esta também promove a homeostase de Treg sem ativar células efetoras. A terapia anti-CD3 / CD7-ricina A, que reduz principalmente as células T e natural killer (NK), tem uma taxa de resposta geral de 60%, com 50% dos doentes atingindo uma resposta completa. A taxa de sobrevivência global em 6 meses é de 60%. Após a eliminação de células efetoras, o sistema imunológico recupera com um repertório de células T diverso, permitindo a tolerância do transplante. Os efeitos imunológicos selectivos e profundos de ambas as terapias na promoção da tolerância imunológica, podem ser usados numa ampla variedade de situações clínicas. Além disso, a metodologia de pesquisa translacional desenvolvida pode ser reaplicada em estudos clínicos futuros. No capítulo 1, encontra-se a introdução geral. Começamos pela definição das células Tregs e explicação de como essas células são essenciais para manter a tolerância e preservação da homeostase do sistema imunológico. Em seguida, analisamos a relação entre as células Treg e o TCTH. Tregs têm a capacidade de mediar a tolerância ao transplante e, quando esse equilíbrio cuidadoso é perturbado, pode desencadear DECH. O desequilíbrio entre as células T efetoras e reguladoras que ocorre durante o DECH é explorado em detalhe. Além disso, destacamos a relevância da terapia de IL-2 em dose-baixa para pacientes com DECH e como a terapia recupera positivamente a população de Tregs. Por fim, descrevemos resumidamente os principais objetivos desta tese. No capítulo elaboramos sobre os objetivos e conteúdo da tese. No capítulo 3, investigamos a diversidade do compartimento das células Treg em recém- nascidos, adultos saudáveis, durante o período de 2 anos após TCTH e em pacientes que sofrem de DECH crónica. Mostramos que os adultos têm quantidades significativamente superiores de Tregs no sangue do que aquelas presentes no sangue do cordão umbilical (CU), mas também têm subpopulações funcionais e de memória adicionais de Tregs que não estão presentes em CU. A quantidade de subpopulações de Tregs funcionais e de memória expande-se do nascimento até à idade adulta. Quanto aos pacientes após TCTH, o repertório subpopulações Treg de memória já se encontra presente após o transplante, enquanto a diversidade de células Treg ainda se expande dentro do período de 2 anos pós- transplante. Os pacientes com DECH demonstram significativamente menos subpopulações distintas de Tregs funcionais, propondo uma correlação entre a falta de heterogeneidade de Tregs com a DECH crónica. No capítulo 4, demonstramos que a terapia com IL-2 em dose-baixa induz seletivamente a expansão de CD4 Tregs e melhora as manifestações clínicas da DECH crónica. Usando citometria de massa, demonstramos no capítulo 4 que baixas concentrações de IL-2 induzem seletivamente a fosforilação de STAT5 em células Helios CD4Tregs e células CD56bright CD16– NK in vitro e in vivo. Os efeitos da terapia de IL-2 em dose-baixa em células T CD4 convencionais e células T CD8 foram limitados ao aumento da expressão de PD-1 em células T efetoras de memória. Os efeitos seletivos da terapia IL-2 em dose- baixa nas células Helios CD4 Tregs e células NK CD56bright induzem a expressão constitutivamente de receptores de IL-2 de alta afinidade. Reconhecendo que precisamos urgentemente de terapias mais eficazes para o tratamento de pacientes com doença aguda do enxerto contra hospedeiro, que não reage a esteróides (RE-aDECH) descrevemos, no capítulo 5, um ensaio clínico de fase I / II que examina a segurança e eficácia de uma nova terapia biológica para RE-aDECH. Uma combinação de anticorpos anti-CD3 e anti-CD7 separadamente conjugados com uma imunotoxina, a ricina A recombinante (CD3 / CD7-IT). Esta induz a depleção in vivo de células T e células NK, e suprime a ativação do receptor celular em células T. No dia 28 após o início da terapia com CD3 / CD7-IT, a taxa geral de resposta foi de 60%, com 50% atingindo uma resposta completa. A taxa de sobrevida global em 6 meses foi de 60%. O tratamento, que foi administrado durante 1 semana, causou depleção profunda, mas transitória de células T e células NK, seguido por rápida recuperação do sistema imunológico com um repertório diverso de células T e preservação de células T específicas capazes de identificar o vírus Epstein-Barr e citomegalovírus. O tratamento com CD3 / CD7-IT foi seguro e bem tolerado pelos doentes, com uma prevalência relativamente baixa de eventos adversos, os quais foram controláveis e reversíveis, como por exemplo hipoalbuminemia, microangiopática e trombocitopenia. Por último, estávamos interessados em testar o mesmo painel de citometria de massa usado no capítulo 3, para estudar as células Treg em outras circunstâncias de distúrbio imunológico, não relacionadas ao TCTH. No capítulo 6, avaliamos o idelalisib como terapia de primeira linha para o tratamento da recidiva leucemia linfocítica crónica (LLC). Após um período de acompanhamento de 14,7 meses (em média), a hepatotoxicidade foi considerada um evento adverso frequente e frequentemente grave. Várias linhas de evidência sugerem que essa hepatotoxicidade foi imuno-mediada. Um infiltrado linfocítico foi visto em amostras de biópsia hepática retiradas de 2 indivíduos com transaminase, e os níveis das citocinas pró-inflamatórias CCL-3 e CCL-4 foram maiores em indivíduos com hepatotoxicidade. Uma diminuição nas células T reguladoras do sangue periférico foi observada em pacientes que sofreram de hepatotoxicidade durante a terapia, o que é consistente com um mecanismo imunomediado. No capítulo 7 concluímos esta tese resumindo e discutindo os resultados.
Descrição
Palavras-chave
Imunologia Células T Células T reguladoras Investigação translational Estudos clínicos Teses de doutoramento - 2021