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Publicação
The mechanism of nonsense-mediated mRNA decay and its players
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Autores
Orientador(es)
Resumo(s)
A expressão génica nos seres vivos tem como objetivo a transferência da informação proveniente dos
ácidos desoxirribonucleicos (DNA) para RNA mensageiro (mRNA) e, a partir deste, proceder à síntese
proteica. Por ser um processo complexo, é preciso haver uma regulação contínua de forma a impedir a
passagem de erros. O decaimento de RNA mensageiro mediado por codões nonsense (NMD) é
considerado um de vários mecanismos de vigilância celular, tendo duas funções: 1) identificação e
degradação de transcritos que contêm codões de terminação prematura da tradução (PTC), evitando a
produção de proteínas truncadas que podem ter efeitos deletérios na célula e 2) regulação de mRNAs
fisiológicos (codificantes de proteínas funcionais) em resposta às necessidades celulares, mantendo a
qualidade da expressão génica. Acredita-se que este mecanismo influencia os níveis de expressão de
aproximadamente 10 % dos transcritos em eucariotas, estando implicado em vários processos biológicos
que moldam o respetivo programa de expressão génica. Além disso, acredita-se que um terço das
mutações encontradas em doenças genéticas humanas, incluindo o cancro, resultam em transcritos
portadores de PTC, que podem ser eliminados por NMD.
No NMD, há vários fatores envolvidos que podem atuar de diferentes maneiras, dependendo do conjunto
de transcritos a regular, contribuindo para a diversificação deste mecanismo em dois modelos principais:
NMD dependente do complexo da junção exão-exão (EJC) e NMD independente de EJC.
Adicionalmente, vários estudos têm observado a ramificação deste mecanismo aquando da depleção de
uma das proteínas intervenientes, havendo a utilização de caminhos alternativos pelos outros fatores
para que se dê a cascata de reações. Por conseguinte, acredita-se que o modelo da via de NMD
dependente de EJC se possa diversificar, por sua vez, em duas vias: uma, dependente da proteína upframeshift 3B (UPF3B) e da proteína do gene 3 candidato à suscetibilidade ao cancro (CASC3); e outra,
dependente da UPF2 e da proteína de ligação a RNA com domínio 1 rico em serina (RNPS1). Ambas
RNPS1 e CASC3 são proteínas associadas ao EJC. No modelo de NMD independente de EJC, há
atuação da UPF3B em associação com UPF2 sem o envolvimento de EJC.
De uma forma geral, após reconhecimento do transcrito, o mecanismo de NMD é ativado, havendo
interação do fator UPF1 com os fatores de terminação da tradução 3 e 1 (eRF3 e eRF1), associados ao
complexo proteico de tradução, e, ainda, com o supressor de efeito morfológico na genitália 1 (SMG1),
formando o complexo SURF. Este complexo irá interagir de forma variável, dependendo dos fatores
envolvidos na reação e, consequentemente, do ramo. Independentemente destes acontecimentos, a
interação destes fatoresirá formar o complexo de indução de decaimento (DECID) e, consequentemente,
a fosforilação da UPF1 pela SMG1, conduzindo ao recrutamento das SMG6 ou SMG5/7, que
desencadeiam a degradação do transcrito.
Alguns estudos identificaram que uma das enzimas envolvidas nesta última etapa é a exoribonuclease
3'-5' independente do exossoma – DIS3L2. Esta enzima está associada a vários processos celulares como
a divisão celular e carcinogénese, assim como ao desenvolvimento de síndrome de Perlman.
O presente estudo visa esclarecer como a proteína DIS3L2 atua no NMD e a sua relação com os vários
ramos deste mecanismo.
No nosso primeiro objetivo, pretendeu-se analisar a correlação entre os diferentes ramos do NMD e a
sua expressão nos cancros do útero e cólo do útero. Para tal, efetuou-se uma análise bioinformática de
dados transcritómicos disponíveis publicamente na plataforma Xena, comparando a expressão de cada
um dos transcritos que codificam para proteínas especificas dos diferentes ramos de NMD — UPF2,
RNPS1, UPF3B e CASC3 — em tecido saudável e cancerígeno, no útero e no cólo do útero. Detetámos
a sobreexpressão do mRNA de RNPS1 e UPF3B em tecidos do cancro de cólo do útero e do útero.
Contrariamente, observou-se níveis baixos de mRNA de CASC3 nas amostras destes dois cancros,
comparativamente com os respetivos níveis em amostras saudáveis. Apesar de não podermos concluir a sua função nestes tecidos, estes três fatores poderão ter um grande potencial clínico como possíveis
biomarcadores de cancro do cólo do útero e do útero e como alvos terapêuticos. Quanto à expressão de
UPF2, embora com diferenças estatisticamente significativas nos seus níveis de mRNA, a gama em que
se encontram os valores observados é muito semelhante entre células saudáveis e cancerígenas nos
tecidos de cólo do útero e de útero e, consequentemente, não podemos concluir o efeito de UPF2. Com
base nestas análises, não se detetou nenhum efeito conjunto a nível de ramos de NMD, sendo que fatores
que constituam o mesmo ramo obtiveram expressões de mRNA diferentes consoante tecido saudável e
cancerígeno. Era de esperar que fatores que constituíssem o mesmo ramo tivessem efeitos semelhantes
aquando da análise da sua expressão transcricional, mas não foi isso que se observou. Desta forma, não
se pode concluir que no cólo do útero e no útero, haja uma atuação especifica de um ramo ou outro do
NMD, mas sim que cada fator se comporta de maneira diferente e, consequentemente, podem influenciar
o próprio mecanismo a atuar positiva ou negativamente na tumorigénese.
O segundo objetivo do estudo teve como intuito investigar em qual dos ramos de NMD, DIS3L2
funciona, em particular, perceber se há uma associação especifica entre DIS3L2 e os ramos de NMD
dependentes de UPF2 e UPF3B (independente de EJC) ou dependentes de UPF2 e RNPS1. Para tal,
selecionou-se, com base nos resultados obtidos em Garcia-Moreno et al. e na literatura disponível, cinco
transcritos-alvo cuja modulação é específica de DIS3L2 e de um fator de cada ramo de NMD (UPF2,
RNPS1 e UPF3B). De seguida, procedeu-se ao silenciamento (KD) singular e combinado de três dos
fatores envolvidos no NMD — UPF2, RNPS1 e UPF3B — e de DISL32 na linha celular HeLa. Após a
avaliação da eficiência de KD, analisou-se o nível de expressão dos transcritos-alvo por transcrição
reversa seguida de reação em cadeia da polimerase (RT-PCR) semiquantitativa em todas as condições
de KD efetuadas. Os respetivos níveis de expressão de mRNA observados por eletroforese foram
quantificados, mas os valores obtidos apresentaram grandes discrepâncias entre replicados, pelo que as
diferenças não foram estatisticamente significativas, o que invalidou a interpretação biológica. Na
verdade, este estudo carece da otimização de diversas condições como a baixa eficiência de
silenciamento que se verificou em alguns dos ensaios e a análise da expressão dos transcritos feita por
RT-PCR, técnica pouco rigorosa, o que pode ter causado a incongruência observada nos resultados dos
ensaios. Assim sendo, não se conseguiu determinar se DIS3L2 atuava em associação com algum dos
ramos de NMD.
Relativamente ao terceiro objetivo, este estudo visou testar que região genómica de transcritos-alvo de
NMD é responsável pelo acionamento da degradação por DIS3L2. Para tal, recorreu-se a um sistema de
construções génicas contendo diferentes combinações das regiões genómicas 5’ e 3’ não traduzidas
(UTR) e codificante do gene GADD45A (alvo conhecido de NMD e DIS3L2), clonadas às do gene beta
()-globina (HBB) (resistente ao NMD e à DIS3L2), com o intuito de formar quatro genes-híbridos e,
sequencialmente, analisar os seus níveis de expressão. Esta análise teve como base resultados anteriores
no grupo, em que se avaliou os níveis de expressão de genes-híbridos contendo combinações de regiões
genómicas dos genes referidos anteriormente, mas cuja região codificante pertencia ao gene HBB.
Verificou-se que a 3’UTR tornava o transcrito mais suscetível à ação de degradação da proteína DIS3L2.
Isto poderá estar relacionado com as proteínas terminais uridiltransferases, que adicionam
oligonucleótidos de uracilo na extremidade 3’ dos transcritos, os quais são reconhecidos pela DIS3L2.
De forma a continuar este estudo, procedeu-se à clonagem dos quatro genes híbridos referidos
anteriormente. Contudo, apenas conseguimos obter três dos quatro construtos inicialmente planeados.
Apesar das várias otimizações feitas durante o processo, não se conseguiu clonar o construto
5’HBB_GADD45A ORF_3’GADD45A.
Em suma, os resultados dos últimos dois objetivos são inconclusivos, havendo necessidade de otimizar
algumas das técnicas efetuadas e continuar com as experiências em falta para obter conclusões
definitivas. Em todo o caso, observámos uma possível associação entre alguns fatores (UPF3B, RNPS1 e CASC3) de NMD e os seus níveis de mRNA em amostras de cancro do útero e do cólo do útero. Por
conseguinte, o papel que o NMD tem ao nível tumorigénico e, como se relaciona com a DIS3L2 na
degradação dos seus diferentes alvos, poderá revelar novos pontos de partida para o desenvolvimento
de futuras estratégias terapêuticas.
Nonsense-mediated mRNA decay (NMD) is a post-transcriptional surveillance mechanism harbouring two functions: identification and degradation of transcripts containing premature translation-termination codons (PTC), preventing deleterious effects in the cell; and downregulation of mRNAs in response to cellular needs, maintaining the quality of gene expression. One-third of gene mutations in human genetic diseases, including cancer, are due to nonsense mutations or frameshift that result in transcripts harbouring nonsense codons and can be eliminated by NMD. The several factors involved in this mechanism may act in diverse ways depending on the set of transcripts to be regulated, contributing to the branching of this pathway. Cytoplasmic DIS3 exosome independent 3′-5′ exoribonuclease 2 (DIS3L2) has been reported as one of the factors to induce NMD targets decay. Therefore, this study aims to enlighten how DIS3L2 functions in NMD: i) analyse the correlation between the distinct branches of NMD and cervical and uterus cancer; ii) investigate which branch guides DIS3L2-mediated degradation; and iii) test which region of the NMD/DIS3L2-targets mediate DIS3L2 degradation through a system of hybrid-genes. For our first aim, we detected no correlation between any of the branches of NMD and uterus and cervical cancer. Each factor acts independently. In our second objective, we analysed the mRNA expression of five transcripts, but none displayed a significant alteration in their expression to infer a correlation between DIS3L2 and a particular NMD branch. Relatively to the last aim, we successfully cloned three out of the four constructs but due to time constrictions we could not continue. Nonetheless, further testing is needed to better understand this mechanism and how transcript degradation is mediated, including the diverse factors needed for its activation, which might be the key to future advanced therapeutic strategies.
Nonsense-mediated mRNA decay (NMD) is a post-transcriptional surveillance mechanism harbouring two functions: identification and degradation of transcripts containing premature translation-termination codons (PTC), preventing deleterious effects in the cell; and downregulation of mRNAs in response to cellular needs, maintaining the quality of gene expression. One-third of gene mutations in human genetic diseases, including cancer, are due to nonsense mutations or frameshift that result in transcripts harbouring nonsense codons and can be eliminated by NMD. The several factors involved in this mechanism may act in diverse ways depending on the set of transcripts to be regulated, contributing to the branching of this pathway. Cytoplasmic DIS3 exosome independent 3′-5′ exoribonuclease 2 (DIS3L2) has been reported as one of the factors to induce NMD targets decay. Therefore, this study aims to enlighten how DIS3L2 functions in NMD: i) analyse the correlation between the distinct branches of NMD and cervical and uterus cancer; ii) investigate which branch guides DIS3L2-mediated degradation; and iii) test which region of the NMD/DIS3L2-targets mediate DIS3L2 degradation through a system of hybrid-genes. For our first aim, we detected no correlation between any of the branches of NMD and uterus and cervical cancer. Each factor acts independently. In our second objective, we analysed the mRNA expression of five transcripts, but none displayed a significant alteration in their expression to infer a correlation between DIS3L2 and a particular NMD branch. Relatively to the last aim, we successfully cloned three out of the four constructs but due to time constrictions we could not continue. Nonetheless, further testing is needed to better understand this mechanism and how transcript degradation is mediated, including the diverse factors needed for its activation, which might be the key to future advanced therapeutic strategies.
Descrição
Tese de Mestrado, Biologia Molecular e Genética, 2024, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências
Palavras-chave
Nonsense-mediated mRNA decay (NMD) DIS3L2 Cancro HeLa Teses de mestrado - 2024