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Understanding the mechanisms at the onset of LAMA2- congenital muscular dystrophy
| Nome: | Descrição: | Tamanho: | Formato: | |
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Autores
Resumo(s)
LAMA2-congenital muscular dystrophy (LAMA2-CMD) is characterized by muscle weakness and
hypotonia present at birth and, currently, no treatment or cure are available. LAMA2-CMD is linked to
mutations in LAMA2, which encodes the laminin α2-chain, a component of laminin 211 (LN211), which
is the most important laminin isoform in mature skeletal muscle. Using the dyW
/dyW mouse model for
LAMA2-CMD, the host laboratory and collaborators established that the disease onset occurs during
fetal development, with muscle growth impairment, numerical reduction of muscle stem cells and
myoblasts, and overactivation of the JAK-STAT3 signaling pathway. Our latest results also point to a
role of the focal adhesion kinase (FAK) in this process. To understand which mechanisms trigger these
defects, a Lama2-deficient C2C12 myoblast cell line was established. Preliminary studies with Lama2-
deficient cells showed alterations in proliferation and differentiation, as well as an increase in DNA
damage and oxidative stress. The aim of this project was to test whether inhibition of FAK and/or
STAT3 counters the LAMA2-CMD phenotype in vitro. For that, first the cell lines required were
generated and their differentiation was analyzed. Data confirmed the impaired differentiation of Lama2-
deficient cells and revealed a significant increase of both nuclear and cytoplasmic NFIX, while MYF5
is apparently retained in cytoplasm in Lama2-deficient cells, both key factors in myogenesis.
Subsequently, these cell lines were used to titrate the FAK and STAT3 inhibitor concentrations and to
test the efficiency of shRNA targeting FAK and STAT3. Results indicate that the use of FAK inhibitor
(3 µM for 2 hours) tends to reduce STAT3 levels, while a reduction in oxidative stress was not observed.
All findings together, will certainly contribute towards a better understanding of the mechanisms
underlying the first steps of LAMA2-CMD, which is essential for the development of therapies targeting
the primary events of this incurable disease.
A distrofia muscular congénita LAMA2 (LAMA2-CMD) é uma doença hereditária autossómica recessiva caracterizada pela manifestação de sintomas como fraqueza muscular grave e hipotonia. O diagnóstico desta doença neurodegenerativa é feito à nascença ou nos primeiros meses de vida, as manifestações da doença vão agravando cada vez mais com o passar do tempo e, como consequência, a esperança média de vida dos afetados é reduzida. Atualmente, esta doença afeta cerca de 1 a 4 em cada 100.000 pessoas em todo o mundo, muitas das quais são crianças. Até à data, os tratamentos disponíveis são direcionados para o melhoramento e alívio dos sintomas, não existindo ainda tratamento ou cura eficaz. Mutações no gene LAMA2 são a principal causa da LAMA2-CMD. Este gene codifica a cadeia α2 das lamininas, presente na glicoproteína laminina-211 (LN211) e também na laminina-221 (LN221). A LN211 é a isoforma mais importante presente no músculo esquelético maduro e desta forma o impacto ao nível do músculo esquelético é tremendo na presença de mutações em LAMA2. Ao nível celular, as lamininas encontram-se numa rede de componentes não celulares presentes em todos os tecidos, sendo conhecida como matriz extracelular (ECM). A ECM fornece suporte físico às células e é composta, entre outros componentes, por colagénios, fibronectina e lamininas. A ECM é também responsável pela sinalização extra e intracelular através de fatores de crescimento e moléculas bioativas que controlam o crescimento celular através da proliferação, migração, diferenciação e até apoptose. Desta forma, mutações em componentes da ECM são a principal causa de muitas distrofias musculares. As lamininas quando se ligam aos recetores membranares integrinas desencadeiam uma série de sinais responsáveis pela adesão, diferenciação e migração celular na fase embrionária do desenvolvimento muscular. Através do uso de um modelo animal de ratinho para LAMA2-CMD, dyW /dyW (dyW), o laboratório, juntamente com os seus colaboradores, estabeleceu que os primeiros sintomas da doença ocorrem entre o dia embrionário 17.5 (E17.5) e o dia E18.5, com comprometimento do crescimento muscular e redução no número de células estaminais musculares (MuSCs) e mioblastos. Ao estudar o músculo esquelético fetal de ratinhos dyW, foi observado que vias de sinalização como o caso das vias JAK/STAT3 e, mais recentemente, da cinase de adesão focal (FAK), se encontram com atividade superior ao normal na ausência da proteína laminina-α2 funcional em comparação com os ratinhos selvagem. Para estudar e perceber em detalhe quais os mecanismos que desencadeiam o aparecimento desta doença, foi gerada uma linha celular de mioblastos C2C12 mutado no gene Lama2 através da técnica de edição de genes CRISPR/Cas9. Para além da reduzida expressão no gene Lama2, estas células são caracterizadas por apresentarem alterações de proliferação, diferenciação, bem como o aumento de danos no DNA e stress oxidativo. A relação entre as vias FAK e JAK/STAT3 ainda não é conhecida bem como a sua influência direta na proliferação e diferenciação celular na ausência de laminina-α2 funcional. O que se sabe é que a ativação destas vias está dependente, entre outras, da sinalização através das lamininas. Na presença de mutações nas lamininas, a sua ligação às integrinas fica comprometida bem como a sua transmissão de sinal. Sendo que as vias do FAK e JAK/STAT são vias que estão relacionadas com a proliferação e diferenciação das células, pensa-se que na ausência da sinalização das lamininas, as células induzam o aumento de expressão de algumas vias. O problema associado é que a ativação excessiva pode ser prejudicial para as células e não se verifique o efeito pretendido pelas mesmas. Resultados anteriores obtidos pelo laboratório mostraram também alterações em alguns fatores de transcrição (TF) envolvidos na miogénese. Estes fatores são responsáveis pela ativação de expressão génica coordenada que induz o momento exato em que as células musculares devem proliferar ou diferenciar. A proteína associada ao sim (YAP), o fator nuclear 1 tipo X (NFIX) e o fator miogénico 5 (MYF5) são alguns TF com alterações na ausência de Lama2. A proteína YAP, como o próprio nome indica, é uma proteína que necessita da associação de outros elementos para desempenhar a sua função no núcleo ou ser degradada por fosforilação no citoplasma quando a sua atividade não é necessária. A atividade do YAP está associada a proliferação celular enquanto que na diferenciação celular o YAP é sinalizado por fosforilação para degradação no citoplasma. Desta forma o YAP pode ser indicado como marcador de proliferação celular. A atividade do YAP pode também estar relacionada com a atividade do MYF5 na proliferação celular, uma vez que o domínio ativador de intensificação de transcrição (TEAD), parceiro de ligação do YAP, é também um elemento necessário para ativação do MYF5. O MYF5 é um dos primeiros fatores miogénicos a ser transcrito no desenvolvimento muscular enquanto que o NFIX é responsável pela transição entre os estádios embrionário e fetal. Recentemente, o papel do NFIX foi também associado à regulação do stress oxidativo causado por danos no musculo esquelético. Tendo em conta o papel crucial da diferenciação no desenvolvimento do músculo, este projeto pretende pesquisar in vitro o efeito fenotípico da LAMA2-CMD através da inibição do FAK e/ou STAT3. Para tal, a linha celular mutada no gene Lama2 foi gerada através da técnica de edição de genes CRISPR/Cas9. A caracterização desta linha celular foi confirmada tendo em conta o fenótipo previamente conhecido, como a baixa expressão do gene Lama2, stress oxidativo causado por danos no DNA e a ativação aumentada do STAT3. Genotipicamente foi também confirmado que esta linha celular apresenta alterações nucleotídicas na zona de corte. A análise de diferenciação celular confirmou a existência de defeitos na formação de miofibras em células com ausência de Lama2. Centrando as atenções em alguns fatores miogénicos, os dados também confirmaram o aumento nuclear e citoplasmático do NFIX, enquanto que o MYF5 está aparentemente retido no citoplasma. De acordo com a alterações verificadas nas vias de sinalização do FAK e STAT3, foram posteriormente utilizados inibidores farmacológicos para perceber os efeitos fenotípicos causados pela inibição dos mesmos. Após o estabelecimento da concentração ideal do inibidor do FAK (3 µM durante 2 horas) os resultados demonstraram uma tendência na redução dos níveis de P-STAT3. Contrariamente, o mesmo não foi observado com a diminuição do stress oxidativo nem dos níveis de NFIX. Adicionalmente foi também testado se as células tratadas com inibidor do FAK conseguiam reverter os efeitos associados com a formação de miofibras, mas os resultados obtidos não revelaram alterações. Para avaliar os efeitos a longo prazo da inibição das proteínas FAK, STAT3 e NFIX foi aplicada uma abordagem genética de silenciamento de RNA. Apesar da confirmação, por sequenciação de Sanger, que as sequências alvo estavam corretamente inseridas no plasmídeo, os resultados obtidos não revelaram redução na expressão das mesmas. Novos ensaios necessitam de ser feitos, tendo em consideração um novo plasmídeo, pois pensa-se que o problema esteja associado à durabilidade de armazenamento do plasmídeo usado. Em suma, a inibição da proteína FAK revelou que a via de sinalização do FAK está de alguma forma diretamente relacionada com a via JAK/STAT3. Os tratamentos a curto prazo não são suficientes para reverter o efeito do stress oxidativo associado às células mutadas em Lama2 e consequencialmente não são verificadas alterações nos níveis de NFIX bem como diferenças na formação de miofibras. Os tratamentos de inibição com efeito a longo prazo podem ser a chave para a redução do stress oxidativo e formação correta de miofibras em células mutadas para Lama2. Desta forma, todos os resultados em conjunto contribuirão certamente para uma melhor compreensão dos mecanismos subjacentes aos primeiros indícios da LAMA2-CMD, o que é essencial para o desenvolvimento de terapias que visem especificamente os eventos primários desta doença incurável.
A distrofia muscular congénita LAMA2 (LAMA2-CMD) é uma doença hereditária autossómica recessiva caracterizada pela manifestação de sintomas como fraqueza muscular grave e hipotonia. O diagnóstico desta doença neurodegenerativa é feito à nascença ou nos primeiros meses de vida, as manifestações da doença vão agravando cada vez mais com o passar do tempo e, como consequência, a esperança média de vida dos afetados é reduzida. Atualmente, esta doença afeta cerca de 1 a 4 em cada 100.000 pessoas em todo o mundo, muitas das quais são crianças. Até à data, os tratamentos disponíveis são direcionados para o melhoramento e alívio dos sintomas, não existindo ainda tratamento ou cura eficaz. Mutações no gene LAMA2 são a principal causa da LAMA2-CMD. Este gene codifica a cadeia α2 das lamininas, presente na glicoproteína laminina-211 (LN211) e também na laminina-221 (LN221). A LN211 é a isoforma mais importante presente no músculo esquelético maduro e desta forma o impacto ao nível do músculo esquelético é tremendo na presença de mutações em LAMA2. Ao nível celular, as lamininas encontram-se numa rede de componentes não celulares presentes em todos os tecidos, sendo conhecida como matriz extracelular (ECM). A ECM fornece suporte físico às células e é composta, entre outros componentes, por colagénios, fibronectina e lamininas. A ECM é também responsável pela sinalização extra e intracelular através de fatores de crescimento e moléculas bioativas que controlam o crescimento celular através da proliferação, migração, diferenciação e até apoptose. Desta forma, mutações em componentes da ECM são a principal causa de muitas distrofias musculares. As lamininas quando se ligam aos recetores membranares integrinas desencadeiam uma série de sinais responsáveis pela adesão, diferenciação e migração celular na fase embrionária do desenvolvimento muscular. Através do uso de um modelo animal de ratinho para LAMA2-CMD, dyW /dyW (dyW), o laboratório, juntamente com os seus colaboradores, estabeleceu que os primeiros sintomas da doença ocorrem entre o dia embrionário 17.5 (E17.5) e o dia E18.5, com comprometimento do crescimento muscular e redução no número de células estaminais musculares (MuSCs) e mioblastos. Ao estudar o músculo esquelético fetal de ratinhos dyW, foi observado que vias de sinalização como o caso das vias JAK/STAT3 e, mais recentemente, da cinase de adesão focal (FAK), se encontram com atividade superior ao normal na ausência da proteína laminina-α2 funcional em comparação com os ratinhos selvagem. Para estudar e perceber em detalhe quais os mecanismos que desencadeiam o aparecimento desta doença, foi gerada uma linha celular de mioblastos C2C12 mutado no gene Lama2 através da técnica de edição de genes CRISPR/Cas9. Para além da reduzida expressão no gene Lama2, estas células são caracterizadas por apresentarem alterações de proliferação, diferenciação, bem como o aumento de danos no DNA e stress oxidativo. A relação entre as vias FAK e JAK/STAT3 ainda não é conhecida bem como a sua influência direta na proliferação e diferenciação celular na ausência de laminina-α2 funcional. O que se sabe é que a ativação destas vias está dependente, entre outras, da sinalização através das lamininas. Na presença de mutações nas lamininas, a sua ligação às integrinas fica comprometida bem como a sua transmissão de sinal. Sendo que as vias do FAK e JAK/STAT são vias que estão relacionadas com a proliferação e diferenciação das células, pensa-se que na ausência da sinalização das lamininas, as células induzam o aumento de expressão de algumas vias. O problema associado é que a ativação excessiva pode ser prejudicial para as células e não se verifique o efeito pretendido pelas mesmas. Resultados anteriores obtidos pelo laboratório mostraram também alterações em alguns fatores de transcrição (TF) envolvidos na miogénese. Estes fatores são responsáveis pela ativação de expressão génica coordenada que induz o momento exato em que as células musculares devem proliferar ou diferenciar. A proteína associada ao sim (YAP), o fator nuclear 1 tipo X (NFIX) e o fator miogénico 5 (MYF5) são alguns TF com alterações na ausência de Lama2. A proteína YAP, como o próprio nome indica, é uma proteína que necessita da associação de outros elementos para desempenhar a sua função no núcleo ou ser degradada por fosforilação no citoplasma quando a sua atividade não é necessária. A atividade do YAP está associada a proliferação celular enquanto que na diferenciação celular o YAP é sinalizado por fosforilação para degradação no citoplasma. Desta forma o YAP pode ser indicado como marcador de proliferação celular. A atividade do YAP pode também estar relacionada com a atividade do MYF5 na proliferação celular, uma vez que o domínio ativador de intensificação de transcrição (TEAD), parceiro de ligação do YAP, é também um elemento necessário para ativação do MYF5. O MYF5 é um dos primeiros fatores miogénicos a ser transcrito no desenvolvimento muscular enquanto que o NFIX é responsável pela transição entre os estádios embrionário e fetal. Recentemente, o papel do NFIX foi também associado à regulação do stress oxidativo causado por danos no musculo esquelético. Tendo em conta o papel crucial da diferenciação no desenvolvimento do músculo, este projeto pretende pesquisar in vitro o efeito fenotípico da LAMA2-CMD através da inibição do FAK e/ou STAT3. Para tal, a linha celular mutada no gene Lama2 foi gerada através da técnica de edição de genes CRISPR/Cas9. A caracterização desta linha celular foi confirmada tendo em conta o fenótipo previamente conhecido, como a baixa expressão do gene Lama2, stress oxidativo causado por danos no DNA e a ativação aumentada do STAT3. Genotipicamente foi também confirmado que esta linha celular apresenta alterações nucleotídicas na zona de corte. A análise de diferenciação celular confirmou a existência de defeitos na formação de miofibras em células com ausência de Lama2. Centrando as atenções em alguns fatores miogénicos, os dados também confirmaram o aumento nuclear e citoplasmático do NFIX, enquanto que o MYF5 está aparentemente retido no citoplasma. De acordo com a alterações verificadas nas vias de sinalização do FAK e STAT3, foram posteriormente utilizados inibidores farmacológicos para perceber os efeitos fenotípicos causados pela inibição dos mesmos. Após o estabelecimento da concentração ideal do inibidor do FAK (3 µM durante 2 horas) os resultados demonstraram uma tendência na redução dos níveis de P-STAT3. Contrariamente, o mesmo não foi observado com a diminuição do stress oxidativo nem dos níveis de NFIX. Adicionalmente foi também testado se as células tratadas com inibidor do FAK conseguiam reverter os efeitos associados com a formação de miofibras, mas os resultados obtidos não revelaram alterações. Para avaliar os efeitos a longo prazo da inibição das proteínas FAK, STAT3 e NFIX foi aplicada uma abordagem genética de silenciamento de RNA. Apesar da confirmação, por sequenciação de Sanger, que as sequências alvo estavam corretamente inseridas no plasmídeo, os resultados obtidos não revelaram redução na expressão das mesmas. Novos ensaios necessitam de ser feitos, tendo em consideração um novo plasmídeo, pois pensa-se que o problema esteja associado à durabilidade de armazenamento do plasmídeo usado. Em suma, a inibição da proteína FAK revelou que a via de sinalização do FAK está de alguma forma diretamente relacionada com a via JAK/STAT3. Os tratamentos a curto prazo não são suficientes para reverter o efeito do stress oxidativo associado às células mutadas em Lama2 e consequencialmente não são verificadas alterações nos níveis de NFIX bem como diferenças na formação de miofibras. Os tratamentos de inibição com efeito a longo prazo podem ser a chave para a redução do stress oxidativo e formação correta de miofibras em células mutadas para Lama2. Desta forma, todos os resultados em conjunto contribuirão certamente para uma melhor compreensão dos mecanismos subjacentes aos primeiros indícios da LAMA2-CMD, o que é essencial para o desenvolvimento de terapias que visem especificamente os eventos primários desta doença incurável.
Descrição
Tese de mestrado, Biologia Molecular e Genética, 2023, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências
Palavras-chave
Lama2 LAMA2-CMD STAT3 FAK diferenciação Teses de mestrado - 2024