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Impact of extracellular vesicles’ cargo in the chemoresistance transfer in glioblastoma
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Autores
Orientador(es)
Resumo(s)
Segundo a Organização Mundial de Saúde (WHO), o glioblastoma (GBM) é uma neoplasia de
classe IV com diferenciação astrocística, responsável por aproximadamente 45% de todos os tumores
cerebrais primários malignos. Devido à sua natureza altamente invasiva e rápida taxa de proliferação, a
ressecção cirúrgica completa do tumor não é exequível. Adicionalmente, a grande heterogeneidade
genética típica deste tumor cerebral possibilita um rápido desenvolvimento de resistência à
quimioterapia e radioterapia utilizadas, e uma consequente célere recidiva tumoral. Para além da sua
grande variabilidade genética intra-paciente, o GBM é também notório pela sua heterogeneidade inter pacientes, o que se revela de forma clara no comportamento patológico diferencial deste tumor, como
por exemplo, na resposta aos diferentes tratamentos. Por este motivo, o GBM foi agrupado em diferentes
grupos, de acordo com a natureza das suas mutações e com a sua expressão fenotípica. Esta informação
pode ser utilizada para personalizar terapias para pacientes com GBM, aumentando assim a sua eficácia.
De acordo com o último relatório da WHO de 2016, que clarifica a classificação de tumores do
sistema nervoso central através da integração tanto de critérios fenotípicos como genotípicos, o GBM
pode ser dividido em dois grupos: Desidrogenase de isocitrato (IDH)-estirpe selvagem e IDH-mutante.
Existe ainda um terceiro grupo que inclui todos os diagnósticos de GBM no qual a avaliação do gene
IDH é inconclusiva. O perfil genotípico mais comum ocorre em cerca de 90% de todos os casos e está
associado a pacientes que apresentam a estirpe selvagem do gene IDH. Esta variante está associada a
GBM primários, isto é, tumores com as suas principais mutações a ocorrem de novo, em pacientes com
mais de 55 anos, com uma idade mediana de 62 anos aquando do diagnóstico. Este grupo está também
associado com uma maior incidência no sexo masculino, com um rácio de 1,42:1 em comparação com
o sexo feminino. A taxa de sobrevivência geral de pacientes neste grupo é de apenas 15 meses após
diagnóstico. Associado a aproximadamente 10% de todos os casos, a segunda variante mais comum
deste tumor está associada com GBM secundários que se desenvolvem em pacientes mais novos, por
volta dos 44 anos. Os pacientes neste grupo apresentam mutações no gene IDH, e normalmente possuem
um histórico clínico de casos de gliomas difusos de baixo grau. A taxa de sobrevivência nesta variante
ronda os 31 meses após o diagnóstico, um pouco mais do dobro quando comparada com a variante IDH estirpe selvagem.
Até ao momento, não existe ainda um claro conjunto de sintomas associados com nenhuma
variante específica. Os sintomas para ambas as variantes podem incluir défices neurológicos focais
progressivos, danos cognitivos e motores, náusea, dor de cabeça e convulsões. Estes sintomas derivam
normalmente de fatores como a localização do tumor, destruição direta de tecido cerebral por necrose,
ou da pressão intracraniana elevada devido ao volume tumoral. Devido a este conjunto de sintomas
ambíguos e a falta de grandes manifestações clínicas, o GBM é normalmente diagnosticado num estádio
avançado, revelando assim uma falta de estratégias de diagnóstico eficientes. Os métodos de diagnóstico
atualmente utilizados consistem em testes neurológicos, neuroimagem e sobretudo realização de
biópsias, apesar do seu caracter invasivo e das limitações deste método em avaliar mudanças na dinâmica
tumoral em tempo real.
O último grande avanço no tratamento do GBM ocorreu em 2005, quando o pró-fármaco
temozolomida (TMZ) foi introduzido em combinação com a radioterapia após ressecção cirúrgica
máxima em segurança do tumor. A TMZ é um agente alquilante capaz de causar quebras na molécula
de ácido desoxirribonucleico (DNA) através da formação de incompatibilidades no emparelhamento de
bases que iniciam ciclos fúteis de reparação de DNA, resultando em morte celular. Este agente é um
pró-fármaco que não necessita de ativação metabólica, uma vez que a TMZ é convertida
espontaneamente ao seu princípio ativo, o catião eletrofílico altamente reativo metildiazónio. Ao contrário de outros fármacos comumente utilizados em quimioterapia, a TMZ tem a capacidade de
atravessar a barreira hematoencefálica e atingir a localização tumoral em concentrações adequadas. Esta
capacidade deve-se não só ao facto de que este pró-fármaco possui uma massa molecular de apenas 194
Da, mas principalmente devido ao seu padrão de degradação a diferentes valores de pH. O efeito
citotóxico e citostático mediado por TMZ é geralmente causado pela metilação de uma guanina na
posição O6, resultando no seu mal emparelhamento com uma timina durante a replicação que despoleta
os vários ciclos fúteis de reparação de DNA mencionados anteriormente. No entanto, este aduto pode
ser reparado pela enzima O6-metilguanina-DNA metiltransferase (MGMT). Metade dos pacientes
diagnosticados com GBM possuem o promotor da enzima MGMT metilado, resultando numa menor
expressão da mesma e num maior efeito citotóxico e citostático. Todavia, a outra metade dos pacientes
é geralmente intrinsecamente resistente a TMZ devido a não possuírem a expressão de MGMT
silenciada. Adicionalmente, após realização de quimioterapia com TMZ, existe uma pressão seletiva
sobre as células para a perda do silenciamento do promotor do gene MGMT, resultando assim em
quimiorresistência a TMZ. Uma vez que existe uma escassez de fármacos aprovados para o tratamento
de primeira linha do GBM, é importante aprofundar o conhecimento das vias biológicas que levam ao
desenvolvimento de resistência à TMZ, com o objetivo de potencialmente melhorar a eficácia do
medicamento e retardar o desenvolvimento de quimiorresistência.
As vesículas extracelulares (EVs) são um grupo heterogéneo de nanoestruturas de bicamada
lipídica, que atuam como transportadoras biológicas de macromoléculas, como lipídios, proteínas e
ácidos nucleicos. A biogénese destas estruturas é altamente dependente do tipo de célula, do seu estado
fisiológico ou patológico e dos estímulos do microambiente celular. Devido às suas funções na
comunicação celular, as EVs estão implicadas em vários processos fisiológicos e patológicos, incluindo
funções importantes na biologia tumoral. Exemplos destas são: a promoção da proliferação e invasão
celular, auxílio no aparecimento de metástases e angiogénese, e desenvolvimento de resistência às
terapias utilizadas. Por este motivo, o estudo de EVs no contexto da biologia tumoral tem recebido
grande atenção. Isto deve-se ao facto destas vesículas terem a potencialidade de servirem como
biomarcadores do estado patológico das células cancerígenas em tempo real, mas também devido ao seu
potencial valor terapêutico.
O objetivo principal do presente estudo foi compreender melhor o impacto das EVs na
transferência de quimiorresistência à TMZ entre linhas celulares com diferentes níveis de resistência.
Deste modo, foram isoladas EVs através de um método baseado na ultracentrifugação diferencial em
gradiente de densidade, sendo posteriormente validadas biologicamente. Estas vesículas foram isoladas
de uma linha celular resistente a este pro-fármaco, T98G, e de uma linha celular sensível, U-251. De
modo a serem identificadas possíveis diferenças na carga de vesículas extracelulares de células tratadas
com TMZ, estas também foram isoladas de células cultivadas na presença deste pró-fármaco. Com a
finalidade de estabelecer a concentração de TMZ utilizada nestas experiências, foram realizados dois
ensaios, um referente à viabilidade celular com MTT e outro para avaliar a proliferação utilizando
sistemas de análise Incucyte®. Para este trabalho, foi estipulado que a concentração de TMZ utilizada
sobre as células T98G e U-251 seria 300 µM e 50 µM, respetivamente.
Utilizando sistemas de análise Incucyte®, ao avaliar a proliferação de células U-251 tratadas
com TMZ juntamente com EVs previamente isoladas, foi possível observar uma maior proliferação
celular nestas condições quando comparadas às células que foram tratadas apenas com TMZ. Apesar da
falta de significado biológico deste resultado, vários estudos publicados no decorrer desta dissertação
corroboraram que as EVs têm a capacidade de transferir quimiorresistência entre células com diferentes
graus de sensibilidade à TMZ. Por exemplo, foi demonstrado que EVs com níveis elevados de ácido
ribonucleico longo não codificante (lncRNA) SBF2-AS1 derivadas de células com resistência a TMZ,
foram capazes de transmitir quimiorresistência a células sensíveis em GBM. Outro estudo do mesmo
laboratório, demonstrou que EVs derivadas de células de GBM resistentes a TMZ contendo níveis
elevados de microRNA 1238 (miR-1238) foram também capazes de conferir resistência em células
sensíveis.
Embora se tenha tornado evidente que as vesículas extracelulares estão implicadas em vários
processos biológicos, incluindo quimiorresistência no GBM, a tradução deste conhecimento em
aplicações clínicas exigirá uma compreensão mais profunda das EVs. Além do já mencionado valor
intrínseco das vesículas extracelulares como biomarcadores do estado patológico, há uma grande janela
de oportunidade no uso destas mesmas vesículas como alvos ou vetores terapêuticos num futuro
próximo.
Glioblastoma (GBM) is a class IV neoplasm with astrocytic differentiation, which accounts for approximately 45% of all primary malignant brain tumours. Due to its highly invasive nature and rapid proliferation rates, complete tumour resection is not viable, while its great genetic heterogeneity enables a fast tumour recurrence and chemoresistance emergence. The last major advance in GBM treatment occurred in 2005, when temozolomide (TMZ) was introduced in combination to radiotherapy after maximal safe tumour resection. Opposed to many chemotherapeutic drugs, TMZ has the capacity to cross the blood-brain barrier and reach intracranial tumour sites in appropriate concentrations. TMZ is an alkylating agent which causes deoxyribonucleic acid (DNA) strand breaks through the formation of base mismatches that initiate futile DNA repair cycles, thus leading to cell death. However, the majority of the patients are either intrinsically chemoresistant or acquire resistance shortly after chemotherapy. Since there is a limited number of drugs available for GBM treatment, there is a need to better understand the biological pathways that leads to TMZ chemoresistance in order to potentially improve drug efficacy. Extracellular vesicles (EVs) are a heterogeneous group of lipid bilayer nanostructures, which acts as biological carriers of macromolecules, such as lipids, proteins and nucleic acids. The biogenesis of these structures is highly dependent on cell-type, microenvironmental stimuli and physiological status of the cells. Due to their role in the interplay between cells, EVs are implicated in several physiological and pathological processes, including important roles in tumour biology. The main goal of the present study was to further understand the impact of extracellular vesicles in the transfer of temozolomide chemoresistance between cell lines with different resistance levels. With the aim of extending the knowledge on the EVs impact on chemoresistance transfer of TMZ in GBM, these vesicles were isolated from a TMZ resistant GBM cell line, T98G, and from a sensitive cell line, U-251. In order to identify possible differences in the cargo of extracellular vesicles from cells treated with temozolomide, these vesicles were also isolated from cells which were cultured in the presence of TMZ. By assessing the cell proliferation of U-251 cells treated with TMZ and isolated EVs, it was possible to observe a less extensive impairment on the cell proliferation when compared to cells that were solely treated with temozolomide. Despite the lack of biological significance of these results, several studies published in the course of this dissertation corroborated that EVs have the capacity to transfer resistance between cells with different degree of TMZ sensitiveness. Although it has become evident that EVs are implicated in several biological processes, including chemoresistance in GBM, the translation of this knowledge into clinical applications will require a deeper understanding of the extracellular vesicles. Besides the intrinsic value of EVs as biomarkers of GBM status, there is a great window of opportunity in using these vesicles as targets or therapeutic delivery vehicles in the near future.
Glioblastoma (GBM) is a class IV neoplasm with astrocytic differentiation, which accounts for approximately 45% of all primary malignant brain tumours. Due to its highly invasive nature and rapid proliferation rates, complete tumour resection is not viable, while its great genetic heterogeneity enables a fast tumour recurrence and chemoresistance emergence. The last major advance in GBM treatment occurred in 2005, when temozolomide (TMZ) was introduced in combination to radiotherapy after maximal safe tumour resection. Opposed to many chemotherapeutic drugs, TMZ has the capacity to cross the blood-brain barrier and reach intracranial tumour sites in appropriate concentrations. TMZ is an alkylating agent which causes deoxyribonucleic acid (DNA) strand breaks through the formation of base mismatches that initiate futile DNA repair cycles, thus leading to cell death. However, the majority of the patients are either intrinsically chemoresistant or acquire resistance shortly after chemotherapy. Since there is a limited number of drugs available for GBM treatment, there is a need to better understand the biological pathways that leads to TMZ chemoresistance in order to potentially improve drug efficacy. Extracellular vesicles (EVs) are a heterogeneous group of lipid bilayer nanostructures, which acts as biological carriers of macromolecules, such as lipids, proteins and nucleic acids. The biogenesis of these structures is highly dependent on cell-type, microenvironmental stimuli and physiological status of the cells. Due to their role in the interplay between cells, EVs are implicated in several physiological and pathological processes, including important roles in tumour biology. The main goal of the present study was to further understand the impact of extracellular vesicles in the transfer of temozolomide chemoresistance between cell lines with different resistance levels. With the aim of extending the knowledge on the EVs impact on chemoresistance transfer of TMZ in GBM, these vesicles were isolated from a TMZ resistant GBM cell line, T98G, and from a sensitive cell line, U-251. In order to identify possible differences in the cargo of extracellular vesicles from cells treated with temozolomide, these vesicles were also isolated from cells which were cultured in the presence of TMZ. By assessing the cell proliferation of U-251 cells treated with TMZ and isolated EVs, it was possible to observe a less extensive impairment on the cell proliferation when compared to cells that were solely treated with temozolomide. Despite the lack of biological significance of these results, several studies published in the course of this dissertation corroborated that EVs have the capacity to transfer resistance between cells with different degree of TMZ sensitiveness. Although it has become evident that EVs are implicated in several biological processes, including chemoresistance in GBM, the translation of this knowledge into clinical applications will require a deeper understanding of the extracellular vesicles. Besides the intrinsic value of EVs as biomarkers of GBM status, there is a great window of opportunity in using these vesicles as targets or therapeutic delivery vehicles in the near future.
Descrição
Tese de Mestrado, Biologia Molecular e Genética, 2021, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências
Palavras-chave
Glioblastoma Quimiorresistência à TMZ Vesículas Extracelulares Teses de mestrado - 2021