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Role of glutathione s-transferase pi in neuronal protection under oxidative stress and proteasome inhibition relevance to Parkinson’s disease
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Resumo(s)
Although the molecular mechanisms underlying DA neuronal death in Parkinson’s disease (PD) are still not completely understood, solid evidence has accumulated implicating mitochondrial dysfunction, oxidative stress and failure of proteolytic pathways in the pathogenesis of the disease. Glutathione S-Transferase pi (GSTP), whose expression is regulated by the nuclear factor-erythroid 2-related factor 2 (Nrf2), has been shown to protect cells from reactive oxygen species by modulating S-glutathionylation of proteins, following oxidative and nitrosative stress, altering the levels of glutathione, and also by acting as a ligand-binding protein controlling the catalytic activity of kinases involved in cell-signaling pathways. Experimental models of PD based on the use of the selective dopaminergic neurotoxin 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP) are widely used as they recapitulate the neurological features of the disease, triggering a cascade of deleterious events that culminate with DA neuronal demise. The main objective of the present work was to characterize the putative neuroprotective role of GSTP against MPTP-induced oxidative stress and to contribute to the elucidation of the role of proteasome inhibition in the MPTP Parkinson’s disease mouse model. Moreover with this work we aimed to further investigate the molecular mechanisms underlying MPTP-induced DA neuronal death. In the first part of this work we have demonstrated in vivo that GSTP is an endogenous regulator of the activity of c-Jun N-terminal kinase (JNK). We show that in mice brain, GSTP is able to bind JNK, through direct protein-protein interaction, inhibiting its activation, and consequently preventing its downstream effects on triggering cell death pathways. Moreover, we showed that GSTP knockout mice display increased susceptibility to MPTP neurotoxicity. We have further characterized GSTP neuroprotective function by demonstrating for the first time that, in vivo GSTP potentiates Kelch ECH associating protein 1 (Keap1) Abstract xxiv S-glutathionylation following MPTP administration, in mice brain. As Keap1 is the major endogenous regulator of Nrf2, Keap1 S-glutathionylation results in the subsequent Nrf2 pathway activation, and increased expression of GSTP, in a positive feedback regulatory loop. Finally, as the ubiquitin-proteasome system (UPS) is also a critical player in several processes involved in the regulation of neuronal survival vs neuronal death pathways, and specifically in the regulation of the Nrf2-elicited antioxidant response, we investigated the modifications in UPS function, upon MPTP-induced oxidative stress and proteasome inhibition, in wild-type and GSTP knockout mice brain. We concluded that different components of the UPS have different susceptibilities to oxidative stress and, importantly GSTP knockout mice display increased susceptibility to UPS damage and inactivation upon MPTP-induced oxidative stress. In conclusion, our results provided new insights into the molecular mechanisms involved in DA neuronal loss and we identified novel mechanisms involved in GSTP-elicited neuronal protection. Overall our results demonstrate important GSTP roles, other than detoxification, namely in the regulation of kinase signaling pathways and consequently in the modulation of cell death cascades, and in the potentiating of S-glutathionylation, thus enhancing antioxidant responses. Therefore the regulation of GSTP expression constitutes a promising therapeutic target in the development of novel therapeutic strategies for the treatment of neurodegenerative diseases and other diseases in which oxidative stress is an important factor of progression.
A doença de Parkinson (PD) é uma doença neurodegenerativa caracterizada pela degenerescência progressiva dos neurónios dopaminérgicos da substantia nigra pars compacta (SNpc) e pela presença de inclusões citoplasmáticas constituídas por agregados proteicos, denominadas corpos de Lewy. A depleção de dopamina, resultante da morte dos neurónios dopaminérgicos, origina perda dos mecanismos de neurotransmissão entre a SNpc e o estriado, onde se situam os terminais nervosos destes neurónios, e conduz à incapacidade de controlo dos movimentos voluntários. Embora se conheçam as características neuroquímicas e neuropatológicas da PD, a sua etiologia bem como os mecanismos moleculares subjacentes à morte dos neurónios dopaminérgicos não estão ainda completamente elucidados. No entanto, resultados de numerosos estudos apontam para um importante papel de factores como o stress oxidativo, a disfunção mitocondrial e a desregulação de vias de degradação proteica, na patogénese das formas familiar e esporádica da PD. O desencadeamento da disfunção do metabolismo proteico, nas formas esporádicas da PD, poderá resultar do stress oxidativo mediado por espécies reactivas de oxigénio (ROS). A isoforma pi da Glutationo S-transferase (GSTP) é um enzima de destoxificação de fase II, que para além de catalisar a reacção de adição nucleofílica do glutationo reduzido a um elevado número de substratos, participando assim na eliminação das ROS, tem sido sugerido como protector em situações de stress oxidativo devido à sua capacidade de estabelecer interacções proteína-proteína, modulando vias de sinalização celulares. Os modelos experimentais baseados na administração da neurotoxina 1-metil-4- fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina (MPTP) a ratinhos mimetizam diversas características neuropatológicas da PD desencadeando uma cascata de eventos causadores de danos celulares, que culmina com a degenerescência selectiva dos neurónios dopaminérgicos. O presente trabalho teve como principal objectivo contribuir para a caracterização do potencial papel neuroprotector da GSTP, em resposta ao stress induzido pelo MPTP e Resumo xxvi à inibição do proteossoma. Mais especificamente foram estudados os mecanismos moleculares subjacentes à perda dos neurónios dopaminérgicos em situações de stress oxidativo induzido pelo MPTP e investigado o papel da inibição do proteossoma neste modelo de PD. Na fase inicial deste trabalho demonstrámos que a administração de MPTP a ratinhos C57BL/6 wild-type (wt) e GSTP knockout (ko) conduz à degenerescência selectiva dos neurónios dopaminérgicos da via nigro-estriado, com perda de densidade dos terminais nervosos no estriado e diminuição do número de neurónios dopaminérgicos no cérebro médio. Os nossos resultados mostraram que a degenerescência dos neurónios dopaminérgicos ocorre mais precocemente nos ratinhos GSTP ko do que nos wt, demonstrando que os ratinhos ko são mais susceptíveis à neurotoxicidade induzida pelo MPTP. Adicionalmente, observámos que o tratamento com MPTP conduz a um aumento da fosforilação da cinase N-terminal da c-Jun (JNK), bem como da sua actividade catalítica e consequentemente da fosforilação de c-Jun. A activação da cascata de sinalização da JNK despoleta vias de morte celular, pelo que os resultados obtidos indicam que esta será uma das vias envolvidas na morte dos neurónios dopaminérgicos induzida pelo MPTP. Os mecanismos moleculares subjacentes à regulação da actividade da JNK em condições de stress celular envolvem a activação de uma cascata de cinases bem como da regulação controlada de diversos repressores endógenos da JNK. Os nossos resultados demonstram que in vivo a GSTP actua como um regulador endógeno da resposta celular ao stress induzido pelo MPTP através da inibição directa da actividade da JNK, por interacção proteína-proteína. O factor de transcrição Nrf2 é um dos principais sensores e reguladores celulares da resposta ao stress oxidativo e a sua actividade é regulada maioritariamente pela proteína Keap1, que encaminha o Nrf2 para degradação pelo proteossoma. A indução da expressão de enzimas de fase II, nomeadamente a GSTP pelo factor de transcrição Nrf2, constitui um potencial mecanismo de defesa celular contra o stress oxidativo induzido pelo MPTP. Numa segunda parte deste trabalho procurámos por um lado clarificar de que forma a inibição do proteossoma, adicionalmente ao stress induzido pelo MPTP, influenciava a regulação da actividade do Nrf2 e quais as consequências na activação da GSTP, e por outro investigar o papel da GSTP na regulação dos mecanismos moleculares activados nestas condições experimentais. Resumo xxvii Os resultados obtidos demonstraram um aumento da formação de ROS bem como um aumento da acumulação de grupos carbonilo nas proteínas, indicando um aumento da quantidade de proteínas oxidadas no cérebro de ratinhos C57BL/6 wt tratados com MPTP e/ou com o inibidor do proteossoma, MG132. Verificou-se também um aumento da reactividade dos astrócitos e da microglia. Conjuntamente estes resultados sugerem uma activação inicial de vias de stress e inflamação, nas quais parece haver um efeito de sinergia resultante da administração simultânea dos dois compostos. Um dos marcadores de estado redox celular mais reconhecidos é o nível de glutationo intracelular, bem como o seu estado de oxidação. Os nossos resultados mostraram um decréscimo de glutationo, acompanhado de um aumento de actividade da peroxidase do glutationo e um decréscimo da actividade da reductase do glutationo, indicando um ambiente celular mais oxidante. No entanto não se verificou um aumento da forma oxidada livre do glutationo nestas condições, provavelmente porque o decréscimo observado nos níveis de glutationo livre se deve à sua conjugação com proteínas, visto que observámos um aumento dos níveis de proteínas S-glutationiladas nos ratinhos wt tratados com MPTP. Mais ainda, através de ensaios de co-imunoprecipitação verificámos a S-glutationilação específica da proteína Keap1, nos ratinhos wt mas não nos GSTP ko. A S-glutationilação conduz à dissociação do complexo entre a Keap1 e o Nrf2, evitando a degradação do Nrf2 pelo proteossoma e conduzindo à sua activação. Nos ratinhos wt tratados com MPTP, observámos ainda um aumento de expressão do Nrf2, bem como da sua translocação para o núcleo, indicativa da sua activação. Ainda de acordo com estes resultados, pudémos observar um aumento dos níveis de expressão da GSTP e da heme oxigenase (HO-1), ambas reguladas pelo Nrf2, nos ratinhos wt tratados com MPTP. No entanto, nos ratinhos ko não se verificou um aumento nos níveis de expressão para a HO-1. Tendo em conta que a GSTP foi sugerida como sendo um dos catalisadores da reacção de S-glutationilação, estes resultados indicam que, em resposta ao stress induzido pelo MPTP, a GSTP catalisa a reacção de S-glutationilação da Keap1, levando à dissociação do complexo Keap1-Nrf2 e à activação do Nrf2. O Nrf2 por sua vez é translocado para o núcleo onde regula a expressão de vários genes, nos quais se incluem GSTP e HO-1. Nos ratinhos GSTP ko, a ausência de GSTP inviabiliza este mecanismo. No seu conjunto, estes resultados demonstram a existência de um mecanismo de regulação por feedback positivo, em que a GSTP ao ser activada em condições de stress, poderá por sua vez deslocar o equilíbrio da reacção de S-glutationilação no sentido da Resumo xxviii glutationilação de diversas proteínas, nomeadamente da Keap1, levando à dissociação do complexo Keap1-Nrf2 e consequentemente a uma maior activação do Nrf2. O conjunto dos nossos resultados permitiu demonstrar pela primeira vez a S-glutationilação da Keap1 in vivo, e consequente activação do Nrf2, revelando um novo mecanismo de protecção neuronal pela GSTP. A disfunção das vias de degradação de proteínas é um dos factores envolvidos na degenerescência dopaminérgica na PD e em modelos experimentais. Por um lado a inibição das vias de degradação, nomeadamente do proteossoma, poderá causar a acumulação de proteínas danificadas por stress oxidativo, e por outro lado a acumulação de proteínas oxidadas poderá levar à sobrecarga e consequente inibição do proteossoma, criando assim uma potenciação cíclica dos danos oxidativos na célula. Na última parte deste trabalho procurámos clarificar de que forma a via da ubiquitina-proteossoma é alterada pela administração de MPTP e/ou MG132, e se existem diferenças entre ratinhos wt e GSTP ko no que diz respeito a esta via. Verificámos que, no cérebro de ratinhos wt e GSTP ko, diferentes componentes da via da ubiquitina proteossoma apresentam diferentes susceptibilidades ao stress induzido pelo MPTP ou ao tratamento com MG132. Mais importante, observámos que os ratinhos ko são mais susceptíveis à disfunção da via da ubiquitina proteossoma, após tratamento com MPTP, relativamente aos wt, apresentando menor capacidade de ubiquitinação e níveis de expressão do enzima de conjugação com a ubiquitina (E1) mais baixos. Uma vez que o aumento da proteólise pode de certo modo funcionar como um mecanismo antioxidante ao degradar proteínas oxidadas ou danificadas, impedindo a sua acumulação, o facto de os ratinhos GSTP ko terem défices nesta via pode contribuir para a sua maior susceptibilidade ao stress induzido pelo MPTP. Estes resultados sugerem que a GSTP pode também ter um papel na protecção/manutenção das vias de degradação proteica em condições de stress oxidativo. Em conclusão, com a realização deste trabalho contribuímos para a elucidação dos mecanismos implicados na degenerescência dos neurónios dopaminérgicos induzida pelo MPTP e identificámos alguns dos mecanismos subjacentes à neuroprotecção conferida pela GSTP. A expressão alterada de GSTP foi já descrita como estando relacionada com diversas patologias humanas. Os resultados aqui apresentados mostram que além de um importante papel na destoxificação, in vivo a GSTP tem a capacidade de regular a actividade catalítica da JNK, afectando a modulação de vias de morte celular, bem como de catalisar a S-glutationilação de proteínas envolvidas na resposta antioxidante. Assim, a regulação da expressão da GSTP revelou ser um importante alvo para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas para o tratamento de doenças neurodegenerativas e outras doenças nas quais o stress oxidativo seja um importante factor de progressão.
A doença de Parkinson (PD) é uma doença neurodegenerativa caracterizada pela degenerescência progressiva dos neurónios dopaminérgicos da substantia nigra pars compacta (SNpc) e pela presença de inclusões citoplasmáticas constituídas por agregados proteicos, denominadas corpos de Lewy. A depleção de dopamina, resultante da morte dos neurónios dopaminérgicos, origina perda dos mecanismos de neurotransmissão entre a SNpc e o estriado, onde se situam os terminais nervosos destes neurónios, e conduz à incapacidade de controlo dos movimentos voluntários. Embora se conheçam as características neuroquímicas e neuropatológicas da PD, a sua etiologia bem como os mecanismos moleculares subjacentes à morte dos neurónios dopaminérgicos não estão ainda completamente elucidados. No entanto, resultados de numerosos estudos apontam para um importante papel de factores como o stress oxidativo, a disfunção mitocondrial e a desregulação de vias de degradação proteica, na patogénese das formas familiar e esporádica da PD. O desencadeamento da disfunção do metabolismo proteico, nas formas esporádicas da PD, poderá resultar do stress oxidativo mediado por espécies reactivas de oxigénio (ROS). A isoforma pi da Glutationo S-transferase (GSTP) é um enzima de destoxificação de fase II, que para além de catalisar a reacção de adição nucleofílica do glutationo reduzido a um elevado número de substratos, participando assim na eliminação das ROS, tem sido sugerido como protector em situações de stress oxidativo devido à sua capacidade de estabelecer interacções proteína-proteína, modulando vias de sinalização celulares. Os modelos experimentais baseados na administração da neurotoxina 1-metil-4- fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina (MPTP) a ratinhos mimetizam diversas características neuropatológicas da PD desencadeando uma cascata de eventos causadores de danos celulares, que culmina com a degenerescência selectiva dos neurónios dopaminérgicos. O presente trabalho teve como principal objectivo contribuir para a caracterização do potencial papel neuroprotector da GSTP, em resposta ao stress induzido pelo MPTP e Resumo xxvi à inibição do proteossoma. Mais especificamente foram estudados os mecanismos moleculares subjacentes à perda dos neurónios dopaminérgicos em situações de stress oxidativo induzido pelo MPTP e investigado o papel da inibição do proteossoma neste modelo de PD. Na fase inicial deste trabalho demonstrámos que a administração de MPTP a ratinhos C57BL/6 wild-type (wt) e GSTP knockout (ko) conduz à degenerescência selectiva dos neurónios dopaminérgicos da via nigro-estriado, com perda de densidade dos terminais nervosos no estriado e diminuição do número de neurónios dopaminérgicos no cérebro médio. Os nossos resultados mostraram que a degenerescência dos neurónios dopaminérgicos ocorre mais precocemente nos ratinhos GSTP ko do que nos wt, demonstrando que os ratinhos ko são mais susceptíveis à neurotoxicidade induzida pelo MPTP. Adicionalmente, observámos que o tratamento com MPTP conduz a um aumento da fosforilação da cinase N-terminal da c-Jun (JNK), bem como da sua actividade catalítica e consequentemente da fosforilação de c-Jun. A activação da cascata de sinalização da JNK despoleta vias de morte celular, pelo que os resultados obtidos indicam que esta será uma das vias envolvidas na morte dos neurónios dopaminérgicos induzida pelo MPTP. Os mecanismos moleculares subjacentes à regulação da actividade da JNK em condições de stress celular envolvem a activação de uma cascata de cinases bem como da regulação controlada de diversos repressores endógenos da JNK. Os nossos resultados demonstram que in vivo a GSTP actua como um regulador endógeno da resposta celular ao stress induzido pelo MPTP através da inibição directa da actividade da JNK, por interacção proteína-proteína. O factor de transcrição Nrf2 é um dos principais sensores e reguladores celulares da resposta ao stress oxidativo e a sua actividade é regulada maioritariamente pela proteína Keap1, que encaminha o Nrf2 para degradação pelo proteossoma. A indução da expressão de enzimas de fase II, nomeadamente a GSTP pelo factor de transcrição Nrf2, constitui um potencial mecanismo de defesa celular contra o stress oxidativo induzido pelo MPTP. Numa segunda parte deste trabalho procurámos por um lado clarificar de que forma a inibição do proteossoma, adicionalmente ao stress induzido pelo MPTP, influenciava a regulação da actividade do Nrf2 e quais as consequências na activação da GSTP, e por outro investigar o papel da GSTP na regulação dos mecanismos moleculares activados nestas condições experimentais. Resumo xxvii Os resultados obtidos demonstraram um aumento da formação de ROS bem como um aumento da acumulação de grupos carbonilo nas proteínas, indicando um aumento da quantidade de proteínas oxidadas no cérebro de ratinhos C57BL/6 wt tratados com MPTP e/ou com o inibidor do proteossoma, MG132. Verificou-se também um aumento da reactividade dos astrócitos e da microglia. Conjuntamente estes resultados sugerem uma activação inicial de vias de stress e inflamação, nas quais parece haver um efeito de sinergia resultante da administração simultânea dos dois compostos. Um dos marcadores de estado redox celular mais reconhecidos é o nível de glutationo intracelular, bem como o seu estado de oxidação. Os nossos resultados mostraram um decréscimo de glutationo, acompanhado de um aumento de actividade da peroxidase do glutationo e um decréscimo da actividade da reductase do glutationo, indicando um ambiente celular mais oxidante. No entanto não se verificou um aumento da forma oxidada livre do glutationo nestas condições, provavelmente porque o decréscimo observado nos níveis de glutationo livre se deve à sua conjugação com proteínas, visto que observámos um aumento dos níveis de proteínas S-glutationiladas nos ratinhos wt tratados com MPTP. Mais ainda, através de ensaios de co-imunoprecipitação verificámos a S-glutationilação específica da proteína Keap1, nos ratinhos wt mas não nos GSTP ko. A S-glutationilação conduz à dissociação do complexo entre a Keap1 e o Nrf2, evitando a degradação do Nrf2 pelo proteossoma e conduzindo à sua activação. Nos ratinhos wt tratados com MPTP, observámos ainda um aumento de expressão do Nrf2, bem como da sua translocação para o núcleo, indicativa da sua activação. Ainda de acordo com estes resultados, pudémos observar um aumento dos níveis de expressão da GSTP e da heme oxigenase (HO-1), ambas reguladas pelo Nrf2, nos ratinhos wt tratados com MPTP. No entanto, nos ratinhos ko não se verificou um aumento nos níveis de expressão para a HO-1. Tendo em conta que a GSTP foi sugerida como sendo um dos catalisadores da reacção de S-glutationilação, estes resultados indicam que, em resposta ao stress induzido pelo MPTP, a GSTP catalisa a reacção de S-glutationilação da Keap1, levando à dissociação do complexo Keap1-Nrf2 e à activação do Nrf2. O Nrf2 por sua vez é translocado para o núcleo onde regula a expressão de vários genes, nos quais se incluem GSTP e HO-1. Nos ratinhos GSTP ko, a ausência de GSTP inviabiliza este mecanismo. No seu conjunto, estes resultados demonstram a existência de um mecanismo de regulação por feedback positivo, em que a GSTP ao ser activada em condições de stress, poderá por sua vez deslocar o equilíbrio da reacção de S-glutationilação no sentido da Resumo xxviii glutationilação de diversas proteínas, nomeadamente da Keap1, levando à dissociação do complexo Keap1-Nrf2 e consequentemente a uma maior activação do Nrf2. O conjunto dos nossos resultados permitiu demonstrar pela primeira vez a S-glutationilação da Keap1 in vivo, e consequente activação do Nrf2, revelando um novo mecanismo de protecção neuronal pela GSTP. A disfunção das vias de degradação de proteínas é um dos factores envolvidos na degenerescência dopaminérgica na PD e em modelos experimentais. Por um lado a inibição das vias de degradação, nomeadamente do proteossoma, poderá causar a acumulação de proteínas danificadas por stress oxidativo, e por outro lado a acumulação de proteínas oxidadas poderá levar à sobrecarga e consequente inibição do proteossoma, criando assim uma potenciação cíclica dos danos oxidativos na célula. Na última parte deste trabalho procurámos clarificar de que forma a via da ubiquitina-proteossoma é alterada pela administração de MPTP e/ou MG132, e se existem diferenças entre ratinhos wt e GSTP ko no que diz respeito a esta via. Verificámos que, no cérebro de ratinhos wt e GSTP ko, diferentes componentes da via da ubiquitina proteossoma apresentam diferentes susceptibilidades ao stress induzido pelo MPTP ou ao tratamento com MG132. Mais importante, observámos que os ratinhos ko são mais susceptíveis à disfunção da via da ubiquitina proteossoma, após tratamento com MPTP, relativamente aos wt, apresentando menor capacidade de ubiquitinação e níveis de expressão do enzima de conjugação com a ubiquitina (E1) mais baixos. Uma vez que o aumento da proteólise pode de certo modo funcionar como um mecanismo antioxidante ao degradar proteínas oxidadas ou danificadas, impedindo a sua acumulação, o facto de os ratinhos GSTP ko terem défices nesta via pode contribuir para a sua maior susceptibilidade ao stress induzido pelo MPTP. Estes resultados sugerem que a GSTP pode também ter um papel na protecção/manutenção das vias de degradação proteica em condições de stress oxidativo. Em conclusão, com a realização deste trabalho contribuímos para a elucidação dos mecanismos implicados na degenerescência dos neurónios dopaminérgicos induzida pelo MPTP e identificámos alguns dos mecanismos subjacentes à neuroprotecção conferida pela GSTP. A expressão alterada de GSTP foi já descrita como estando relacionada com diversas patologias humanas. Os resultados aqui apresentados mostram que além de um importante papel na destoxificação, in vivo a GSTP tem a capacidade de regular a actividade catalítica da JNK, afectando a modulação de vias de morte celular, bem como de catalisar a S-glutationilação de proteínas envolvidas na resposta antioxidante. Assim, a regulação da expressão da GSTP revelou ser um importante alvo para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas para o tratamento de doenças neurodegenerativas e outras doenças nas quais o stress oxidativo seja um importante factor de progressão.
Descrição
Tese de doutoramento, Farmácia (Bioquímica), Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2012
Palavras-chave
Teses de doutoramento - 2012