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Authors
Abstract(s)
A leucemia linfoblástica aguda de células T (LLA-T) é uma neoplasia hematológica agressiva que se caracteriza por uma proliferação anormal e descontrolada de progenitores de linfócitos T. LLA-T representa cerca de 15% dos casos de leucemia linfoblástica aguda (LLA) em doentes pediátricos e 25% dos casos de LLA em adultos. Apesar dos regimes intensivos de quimioterapia utilizados atualmente no tratamento de LLAT, o prognóstico dos doentes que apresentam resistência primária ou adquirida ao tratamento é reservado, o que requer a procura de novos alvos e/ou estratégias terapêuticas. A via de sinalização Notch, que tem um papel fundamental na hematopoiese e em particular no processo de diferenciação e maturação dos linfócitos T, está associada ao desenvolvimento de LLA-T. Mutações que levam à ativação constitutiva desta via de sinalização verificam-se em aproximadamente 60% dos doentes com LLA-T. Por este motivo, a via Notch tem sido um importante alvo terapêutico, contra a qual têm sido desenvolvidos agentes terapêuticos capazes de bloquear a sua ativação, como os inibidores das enzimas γ- secretase. No entanto, estes fármacos são altamente tóxicos para o trato gastrointestinal e em contexto clínico a sua eficácia terapêutica tem demonstrado ser limitada. Nem só a via Notch tem sido associada a LLA-T. A via de sinalização Wnt, também com um papel crucial no desenvolvimento de linfócitos T, está alterada em amostras de doentes com LLAT, nomeadamente no que diz respeito aos níveis de transcrição e expressão de elementos necessários à ativação da via (β-catenina e LEF1). A ocorrência de mutações nestes mesmos elementos também foi verificada. Durante o estudo do papel do microRNA miR-181ab1 em LLA-T induzida por mutações em NOTCH1 verificou-se que este microRNA promove o desenvolvimento de LLA-T, ao inibir a expressão de NRARP, um regulador negativo da via Notch. A proteína NRARP está envolvida no processo de desenvolvimento dos linfócitos T, tendo sido verificado que quando é sobreexpressa em células estaminais hematopoiéticas, a diferenciação destas em linfócitos T maturos fica comprometida. Além disto, NRARP tem sido associada à via de sinalização Wnt, mas como um regulador positivo desta, através da promoção da estabilidade do fator de transcrição LEF1. Para investigar o papel da proteína NRARP em LLA-T, investigadores do laboratório onde foi desenvolvida esta tese analisaram amostras primárias e linhas celulares de LLA-T tendo sido verificado que os níveis de NRARP estavam significativamente aumentados em comparação com timócitos normais. Neste contexto, estabeleceram-se linhas celulares de LLA-T com sobreexpressão de NRARP onde se concluiu que em células de LLA-T com mutações em NOTCH1, a sobre-expressão desta proteína leva à diminuição da proliferação celular. Curiosamente, por outro lado, em células de LLA-T sem mutações em NOTCH1, quando NRARP é sobre-expressa ocorre um aumento da proliferação celular. Em termos de sinalização celular, verifica-se uma diminuição da expressão da proteína cMYC (promotor de proliferação celular) em células de LLA-T com mutações em NOTCH1. No entanto, verifica-se um aumento da expressão desta proteína em células de LLA-T sem mutações em NOTCH1. Considerando que cMYC é um alvo transcricional da via Notch, mas também de outras vias de sinalização, incluindo a via Wnt, foi proposto o envolvimento desta via no aumento da proliferação de células LLA-T sem mutações em NOTCH1. Resultados preliminares, mostram que a sobre-expressão de NRARP em células de LLA-T sem mutações em NOTCH1 promove um aumento dos níveis proteicos de β-catenina, o que indica um aumento da ativação da via Wnt. Assim, o objetivo desta tese é perceber o papel da proteína NRARP em termos funcionais e mecanísticos, na regulação da via de sinalização Wnt, em LLA-T. Em primeiro lugar, analisámos o impacto funcional da inibição da via Wnt em células de LLAT com e sem sobre-expressão de NRARP, de modo a conseguirmos correlacionar a importância desta via na proliferação e viabilidade das células, com a presença de mutações em NOTCH1. Verificámos que as células sem mutações em NOTCH1 e com sobre-expressão de NRARP são mais sensíveis à inibição da via Wnt do que as células sem sobre-expressão de NRARP, demonstrando não só que NRARP tem um papel crucial na ativação desta via, mas também que a ativação da via Wnt é necessária para a proliferação e viabilidade destas células. Relativamente às células com mutações em NOTCH1, observou-se que estas, apesar de inicialmente sensíveis ao inibidor têm a capacidade de recuperar dos efeitos deste, atingindo níveis de proliferação e viabilidade superiores aos das células controlo (células não tratadas). Este fenómeno sugere que a inibição da via Wnt pode ter um efeito protetor nestas células. Posteriormente, com o objetivo de dissecar o mecanismo pelo qual NRARP regula a via Wnt, investigamos se, tal como descrito noutro contexto, NRARP estabiliza a proteína LEF1. Para tal, utilizaram-se células com e sem mutações em NOTCH1 com sobre-expressão de NRARP onde se procedeu à diminuição da expressão de LEF1, utilizando um RNA de interferência (shRNA). Verificou-se que nas células sem mutações em NOTCH1, após diminuição dos níveis de LEF1, ocorre uma diminuição da proliferação celular, sendo este efeito mais significativo nas mesmas células quando NRARP é sobre-expressa. Estes resultados apoiam hipótese de que células de LLA-T sem mutações em NOTCH1 necessitam da ativação da via Wnt para proliferarem e que NRARP regula a ativação desta via através da proteína LEF1. Nas células com mutações em NOTCH1, a diminuição dos níveis de LEF1 não promove alterações na proliferação celular quando NRARP é sobre-expressa. No entanto, nas células parentais, a diminuição da expressão de LEF1 induz um aumento da proliferação celular, sugerindo que a via de sinalização Wnt tem um efeito inibitório na proliferação de células com mutações em NOTCH1. Após confirmar que é através de LEF1 que NRARP regula a via de sinalização Wnt, fomos avaliar se NRARP regula diretamente LEF1 e se interage com alguma isoforma especifica deste. Em linha com os resultados dos ensaios funcionais, colocámos a hipótese de que em células LLAT sem mutações em NOTCH1, NRARP deveria interagir com a isoforma longa de LEF1 que promove ativação da via Wnt. Por outro lado, em células com mutações, NRARP interagiria com a isoforma curta que não promove a via Wnt. Assim, realizámos ensaios de co-imunoprecipitação onde concluímos que NRARP se liga a LEF1 em células de LLA-T com e sem mutações em NOTCH1, quando NRARP é sobre-expressa ou não. No que diz respeito à isoforma envolvida na interação verificámos que NRARP interage com a isoforma de comprimento longo em células de LLA-T com e sem mutações em NOTCH1, o que contraria em parte a hipótese colocada. Para confirmar estes resultados, procedemos a ensaios de PLA (Proximity ligation assay) que permitem avaliar se duas proteínas interagem e ainda quantificar o número de interações. Desta forma, conseguimos confirmar que LEF1 e NRARP interagem e aferir que a percentagem de células com interações aumenta significativamente quando NRARP é sobre-expressa, em células de LLA-T com ou sem mutações em NOTCH1. Para determinar se o aumento de interações entre LEF1 e NRARP é traduzido na ativação da via de sinalização Wnt, realizaram-se ensaios de co-imunoprecipitação onde se procedeu à precipitação de LEF1 e de β-catenina, seguida da deteção de β-catenina e LEF1, respetivamente. Verificou-se que estas duas proteínas interagem em células de LLA-T com e sem mutações em NOTCH1. Procedemos ainda à realização de ensaios de PLA para quantificar as interações entre LEF1 e β-catenina, e deste modo avaliar o grau de ativação da via Wnt nas diferentes células de LLA-T e de que forma NRARP modula essa ativação. Numa perspetiva geral observámos que o número de interações LEF1-β-catenina é significativamente maior em células sem mutações em NOTCH1 comparativamente a células com mutações. Verificámos ainda que quando a proteína NRARP é sobre-expressa, o número de interações aumenta em células sem mutações em NOTCH1. No entanto o mesmo não se verifica em células com mutações. Isto permitiu-nos concluir que nas células sem mutações em NOTCH1, a proteína NRARP promove o aumento da ativação da via da Wnt. Nas células com mutações em NOTCH1, apesar do número de interações LEF1-NRARP aumentar após sobre-expressão de NRARP, isso não se traduz num aumento do número de interações LEF1-β-catenina e consequentemente na ativação da via Wnt. Assim sendo, são necessárias mais experiências para elucidar o mecanismo responsável pela não ativação da via Wnt nestas células, sabendo que NRARP está a interagir com LEF1. Em suma, estes resultados demonstram que nas células sem mutações em NOTCH1, NRARP promove a ativação da via Wnt, através da interação com LEF1. Além disso, a ativação desta via é necessária para que estas células proliferem e se mantenham vivas. Em células com mutações em NOTCH1, NRARP não promove a ativação da via Wnt, apesar da sobre-expressão desta proteína resultar num aumento da sua interação com LEF1.Verificou-se ainda que a via Wnt não é fundamental para a manutenção funcional destas células e ainda que a sua inibição parece acarretar benefícios ao nível da proliferação e viabilidade celular.
T-cell acute lymphoblastic leukemia (T-ALL) is an aggressive hematological malignancy characterized by the abnormal and uncontrolled proliferation of immature T-cell progenitors, accounting for 15% of pediatric and 25% of adult cases of ALL. Despite the recent advances in therapeutic approaches, patients’ prognosis remains poor due to primary or acquired resistance to treatment. Deregulations in Notch and Wnt signaling pathways have been shown to contribute to T-ALL development. Of note, NOTCH1-activating mutations are present in approximately 60% of TALL cases and upregulation of Wnt signaling main drivers, LEF1 and β-catenin, have also been reported in both pediatric and adult T-ALL patients. The loss of the mir-181ab1 inhibits NOTCH1-induced T-ALL development, by de-repressing NRARP which is a negative regulator of Notch signaling. Importantly, NRARP also function as a positive regulator of Wnt signaling by promoting LEF1 stability, a transcription factor absolutely required for the activation of this pathway. NRARP has a dual role in the proliferation of T-ALL cells. In cells harboring NOTCH1 mutations, NRARP overexpression blocks cell proliferation. In contrary, in T-ALL cells without NOTCH1 mutations, it promotes cell proliferation. These results suggest the involvement of different signaling pathway(s) in the regulation of these cells proliferation. Because NRARP is a positive regulator of Wnt signaling, it was hypothesized that this pathway may be involved in the proliferation of T-ALL cells without NOTCH1 mutations. Here, we aimed at exploring if and how NRARP modulates Wnt signaling in T-ALL. First, by evaluating the functional importance of this pathway in T-ALL cells, and then by dissecting the mechanism underlying Wnt signaling regulation by NRARP. Our results show that NRARP is involved in Wnt signaling activation in T-ALL cells without NOTCH1 mutations. Furthermore, Wnt pathway is required for proliferation and survival of these cells. Regarding NOTCH1 mutant cells, NRARP does not seems to have a role in the regulation of Wnt signaling. Interestingly, blocking this pathway has a protective effect on these cells, promoting an increase in cell growth and viability. We also found that NRARP regulates Wnt signaling through LEF1 protein. In addition, NRARP overexpression leads to an increase in the number of LEF1-NRARP interactions in T-ALL cells. However, this increase is only translated into Wnt signaling activation in T-ALL cells without NOTCH1 mutations. Overall, we conclude that proliferation of T-ALL cells without NOTCH1 mutations is promoted by NRARP that positively modulates Wnt signaling, through interaction with LEF1.
T-cell acute lymphoblastic leukemia (T-ALL) is an aggressive hematological malignancy characterized by the abnormal and uncontrolled proliferation of immature T-cell progenitors, accounting for 15% of pediatric and 25% of adult cases of ALL. Despite the recent advances in therapeutic approaches, patients’ prognosis remains poor due to primary or acquired resistance to treatment. Deregulations in Notch and Wnt signaling pathways have been shown to contribute to T-ALL development. Of note, NOTCH1-activating mutations are present in approximately 60% of TALL cases and upregulation of Wnt signaling main drivers, LEF1 and β-catenin, have also been reported in both pediatric and adult T-ALL patients. The loss of the mir-181ab1 inhibits NOTCH1-induced T-ALL development, by de-repressing NRARP which is a negative regulator of Notch signaling. Importantly, NRARP also function as a positive regulator of Wnt signaling by promoting LEF1 stability, a transcription factor absolutely required for the activation of this pathway. NRARP has a dual role in the proliferation of T-ALL cells. In cells harboring NOTCH1 mutations, NRARP overexpression blocks cell proliferation. In contrary, in T-ALL cells without NOTCH1 mutations, it promotes cell proliferation. These results suggest the involvement of different signaling pathway(s) in the regulation of these cells proliferation. Because NRARP is a positive regulator of Wnt signaling, it was hypothesized that this pathway may be involved in the proliferation of T-ALL cells without NOTCH1 mutations. Here, we aimed at exploring if and how NRARP modulates Wnt signaling in T-ALL. First, by evaluating the functional importance of this pathway in T-ALL cells, and then by dissecting the mechanism underlying Wnt signaling regulation by NRARP. Our results show that NRARP is involved in Wnt signaling activation in T-ALL cells without NOTCH1 mutations. Furthermore, Wnt pathway is required for proliferation and survival of these cells. Regarding NOTCH1 mutant cells, NRARP does not seems to have a role in the regulation of Wnt signaling. Interestingly, blocking this pathway has a protective effect on these cells, promoting an increase in cell growth and viability. We also found that NRARP regulates Wnt signaling through LEF1 protein. In addition, NRARP overexpression leads to an increase in the number of LEF1-NRARP interactions in T-ALL cells. However, this increase is only translated into Wnt signaling activation in T-ALL cells without NOTCH1 mutations. Overall, we conclude that proliferation of T-ALL cells without NOTCH1 mutations is promoted by NRARP that positively modulates Wnt signaling, through interaction with LEF1.
Description
Tese de mestrado, Biologia Molecular e Genética, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2018
Keywords
Leucemia linfoblástica aguda de células T (LLA-T) Via de sinalização Notch Via de sinalização Wnt NRARP LEF1 Teses de mestrado - 2018