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Publicação
Development of magnetic responsive nanocomposite scaffolds for tendon tissue engineering
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Resumo(s)
Atualmente, lesões de tendões e doenças relacionadas representam alguns dos problemas músculo-esqueléticos mais frequentes, afetando tanto a população fisicamente activa como indivíduos mais sedentários. Lesões de tendões prejudicam significativamente a qualidade de vida das pessoas afetadas, dado o papel fundamental destes tecidos para o sistema locomotor. A sua capacidade de regeneração é, no entanto, bastante limitada devido à sua natureza hipovascular e hipocelular. Isto significa que, em caso de lesão, o processo natural de cicatrização muito possivelmente resultará numa perda de propriedades estruturais e, consequentemente, mecânicas. Por outro lado, os tratamentos atualmente disponíveis, dos quais a cirurgia é o procedimento mais comum, são pouco eficazes, resultando frequentemente em tecidos pouco funcionais. Os tendões são tecidos mecanossensíveis essenciais ao funcionamento do sistema locomotor, visto que transmitem forças entre os músculos e o esqueleto, possibilitando o movimento. O seu comportamento biomecânico, particularmente a capacidade de suporte de carga, deve-se à organização hierárquica e anisotrópica da sua matriz extracelular. As células residentes dos tendões (tenócitos) mantêm a homeostase do tecido, remodelando a matriz extracelular em resposta a forças externas, através de um processo denominado mecanotransdução. Os tendões são maioritariamente compostos por Colagénio I (60 - 85 %) agregado em fibrilas alinhadas paralelamente, que por sua vez se agrupam formando fibras. O próprio tendão é composto por estruturas sucessivamente menores encaixadas umas dentro das outras, tal que existem divisões físicas entre aglomerados de fibras de colagénio (fascículos). Estas divisões não só contribuem para as propriedades mecânicas do tendão, como previnem que uma lesão se estenda a todo o tecido. Posto isto, é de extrema importância a produção de scaffolds que sinergicamente reproduzam as propriedades estruturais e mecânicas de tendões nativos e sejam capazes de ser atuados de forma remota para estimular mecanicamente as células e subsequentemente promover a regeneração dos tecidos. Dado que os tendões são tecidos fibrosos, scaffolds para regeneração de tendão devem ser igualmente fibrosos e anisotropicamente alinhados. De entre as técnicas de fabrico mais usadas em engenharia de tecidos, electrospinning permite obter fibras com diâmetros desde algumas centenas de nanómetros até alguns micrómetros, de modo a que a escala das estruturas do tecido nativo seja replicada. Assim, linhas contínuas formadas por fibras alinhadas (continuous and aligned fibre threads,) foram fabricadas por electrospinning e posteriormente agregadas em fios (yarns). Estes yarns são estruturas 3D, organizadas hierarquicamente, que mimetizam a arquitetura dos fascículos em tendões nativos, enquanto os threads replicam as respetivas fibras de colagénio. Os threads foram produzidos com uma matriz de PCL reforçada por nanocristais de celulose (cellulose nanocrystals, CNCs) decorados com nanopartículas superparamagnéticas (MNP) de óxido de ferro. Os CNCs são nanopartículas biocompatíveis e com excelentes propriedades mecânicas que foram obtidas por hidrólise ácida da celulose. Por sua vez, as MNPs possuem uma magnetização elevada na presença de um campo magnético externo, sendo também biocompatíveis. Estas foram adsorvidas aos CNCS através de um método de co-precipitação in situ, criando assim um sistema híbrido (MNP@CNC) capaz de reforçar mecanicamente os yarns e permtir a sua atuação remota. Para simultaneamente assegurar a estabilidade química e coloidal destas partículas e também melhorar a sua compatibilidade com a matriz polimérica, MNP@CNC foram cobertas com finas camadas de polidopamina, que foram posteriormente modificadas com dodecanetiol (1-DT). A polidopamina é um biopolímero sintético que resulta da auto-oxidação da dopamina, cuja composição química, contendo grupos amina e catecol, permite a formação de camadas com fortes propriedades adesivas em praticamente qualquer superfície. Por sua vez, a longa cadeia alquila do 1-DT confere às partículas um revestimento hidrofóbico, necessário para a incorporação em PCL. A morfologia dos threads aqui produzidos por electrospinning, nomeadamente o diâmetro e o alinhamento das fibras, varia consoante a quantidade de nanopartículas incorporadas (0 – 5 wt.%) e a sua velocidade de recolha durante o processo de spinning. Verificou-se que existe um aumento do diâmetro tanto das fibras como do próprio thread com o aumento de MNP@CNC revestidas (DT-NP). Por outro lado, a velocidade de recolha influencia tanto o diâmetro como o alinhamento das fibras: com o aumento da velocidade há uma diminuição do diâmetro das fibras acompanhado por um aumento do grau de alinhamento das mesmas. Assim, os threads produzidos com 0, 2.5 e 5 wt.% DT-NP apresentaram diâmetros mínimos de 44.85 ± 8.26 μm, 65.13 ± 9.99 μm e 62.01 ± 12.27 μm, respetivamente, obtidos com uma velocidade de recolha de 0.73 cm.s-1. As fibras correspondentes apresentaram diâmetros de 0.71 ± 0.28 μm, 0.66 ± 0.25 μm e 1.31 ± 0.44 μm, respetivamente. As fibras e fibrilas de colagénio em tendões nativos têm dimensões médias de 1-20 μm e 20-150 nm, respetivamente. Por esta razão, os threads produzidos e as correspondentes fibras exibiram dimensões mais próximas às dos fascículos (150-1000 μm) e fibras de colagénio em tendões nativos, do que às das fibras e fibrilas de colagénio, respetivamente. Contudo, a literatura sugere que scaffolds produzidos com fibras de dimensões na ordem de alguns micrómetros, não só beneficiam o fenótipo tenogénico como também replicam a topografia de um tendão nativo durante a fase de remodelação do processo regenerativo. A incorporação de pequenas quantidades (2.5 ou 5 wt.%) de DT-NP nos yarns de PCL melhorou significativamente as suas propriedades mecânicas, sendo o aumento proporcional à quantidade de DT-NP incorporadas. O módulo de Young aumentou de 10.88 ± 0.96 para 21.55 ± 4.68 MPa e o limite de resistência à tração (ultimate tensile strength) de 2.84 ± 0.48 para 4.22 ± 0.50 MPa em yarns com 5 wt.% DT-NP comparativamente a yarns não reforçados. Em particular, a incorporação de 5 wt.% DT-NP conferiu aos yarns propriedades mecânicas na gama fisiológica dos tecidos nativos (20-1200 MPa e 5-100 MPa para o módulo de Young e limite de resistência à tração, respetivamente). Simultaneamente, a presença de DT-NP possibilitaram a atuação remota dos yarns, ao permitirem a sua magnetização em resposta à aplicação de um campo magnético externo. A magnetização foi também proporcional à quantidade de DT-NP incorporadas, sendo, portanto, superior em yarns com 5 wt.% DT-NP. Posteriormente, o desempenho biológico dos yarns magnéticos, nomeadamente a capacidade de induzir a diferenciação tenogénica, foi avaliada através da cultura de células estaminais do tecido adiposo humano (human adipose stem cells, hASCs) em yarns com 5 wt.% DT-NP, sob a influência ou na ausência de um estímulo magnético. Como foi referido, as células adaptam o seu comportamento em resposta a estímulos físicos transmitidos pela matriz extracelular através de mecanotransdução. Neste caso, o campo magnético aplicado atua sobre as nanopartículas magnéticas, o que causa a sua vibração dentro do material e consequentemente induz pequenas deformações nas respetivas fibras. Verificou-se que a topografia dos yarns, por si só, induz o alongamento do citoesqueleto bem como o seu alinhamento segundo a direção longitudinal das fibras. No entanto, a estimulação magneto-mecânica induziu um maior grau de alinhamento anisotrópico de células na direção das fibras, relativamente à cultura estática. O alongamento do citoesqueleto é induzido devido à ativação de reguladores de transcrição relacionadas com a mecanotransdução, sendo que a expressão destas proteínas foi significativamente superior em células mecanicamente estimuladas. Deste modo, houve uma transmissão eficaz de estímulos mecânicos que consequentemente promoveu o alongamento de células, que é particularmente importante para o compromisso tenogénico. A expressão génica das hASCs foi analisada após 11 dias de cultura com o intuito de avaliar o seu compromisso tenogénico, bem como a capacidade de modulação da resposta inflamatória. Dado que um scaffold induz inevitavelmente inflamação no local de implantação, é importante que o mesmo promova a remodelação do tecido nativo, sem causar inflamação crónica ou fibrose. Posto isto, verificou-se expressão de marcadores tenogénicos e inibição de marcadores osteogénicos e condrogénicos. Em particular, hASCs cultivadas sob estimulação magneto-mecânica apresentaram uma maior expressão de marcadores relacionados com o compromisso tenogénico de células estaminais, TNMD (Tenomodulina) e SCX (Scleraxis). Além disso, houve inibição de citocinas pro-inflamatórias e promoção de citocinas anti-inflamatórias mais acentuadas em hASCs cultivadas sob estímulo mecânico. Em suma, a incorporação de DT-NP em scaffolds cuja estrutura mimetiza a organização da matriz extracelular de tendões, melhorou as suas propriedades mecânicas, colocando-as na gama fisiológica dos tecidos nativos, e conferiu-lhes propriedades superparamagnéticas. A atuação remota dos scaffolds, através da aplicação de um campo magnético, provocou a ativação de vias de sinalização relacionadas com a mecanotransdução em células estaminais. Desta forma, confirmou-se uma transmissão eficaz do estímulo mecânico que se traduziu na diferenciação tenogénica de células estaminais e na modulação da resposta inflamatória. Assim, apresenta-se aqui uma estratégia cujas principais características são, de um ponto de vista clínico, vantajosas não só para a recuperação de um tecido totalmente funcional após uma lesão, mas também para a prevenção de fibrose e inflamações crónicas.
Tendons are mechanosensitive tissues that enable skeletal movement by allowing an effective transmission of forces between muscles and bones. Their biomechanical behaviour, particularly their load-bearing capabilities, can be attributed to the anisotropically aligned and hierarchical organization of their extracellular matrix. However, their healing capacity is quite limited, meaning that, in the event of an injury, tendon natural healing will most likely result in a loss of structural and therefore mechanical properties. Thus, the fabrication of scaffolds that synergistically replicate the native tendons structural and mechanical properties and are capable of being remotely actuated to mechanically stimulate cells would be of considerable interest to promote tissue regeneration. For this purpose, continuous and aligned electrospun nanofibre threads were fabricated and assembled by textile techniques into yarns, 3D hierarchical constructs mimicking the fibrous architecture of native tendons fascicles. These yarns were based on a PCL matrix mechanically reinforced with cellulose nanocrystals (CNCs) decorated with superparamagnetic iron oxide nanoparticles (MNP@CNC). To simultaneously assure these particles chemical and colloidal stability and improve their interfacial compatibility with the polymer matrix, MNP@CNC were coated with thin layers of polydopamine that were further grafted with hydrophobic dodecanethiol (DT-NP). The incorporation of small amounts of DT-NP (0 – 5wt.%) significantly improved the mechanical properties of the nanofibre yarns, simultaneously endowing them with magnetic responsiveness. Moreover, the biological performance and functionality of the fabricated constructs, namely the capacity to induce tenogenic differentiation, was assessed by culturing human adipose stem cells (hASCs) under the influence or absence of magnetic stimulus. Magneto-mechanical stimulation of cells promoted high expression of tendon-related markers, such as Tenomodulin and Scleraxis, and activation of the YAP/TAZ signalling pathway, that regulates mechanotransduction. Moreover, cells under magneto-mechanical stimulation upregulated genes related with anti-inflammatory cytokines while downregulating pro-inflammatory factors. Overall, the nanofibre yarns were applied to create a magnetically responsive system that, combined with a tendon mimetic architecture, was able to mechanically stimulate cells. As result the proposed system boosted hASCs tenogenic commitment and synergistically had a positive effect on the modulation of their inflammatory response, both of which might play key roles to achieve on tendon regeneration.
Tendons are mechanosensitive tissues that enable skeletal movement by allowing an effective transmission of forces between muscles and bones. Their biomechanical behaviour, particularly their load-bearing capabilities, can be attributed to the anisotropically aligned and hierarchical organization of their extracellular matrix. However, their healing capacity is quite limited, meaning that, in the event of an injury, tendon natural healing will most likely result in a loss of structural and therefore mechanical properties. Thus, the fabrication of scaffolds that synergistically replicate the native tendons structural and mechanical properties and are capable of being remotely actuated to mechanically stimulate cells would be of considerable interest to promote tissue regeneration. For this purpose, continuous and aligned electrospun nanofibre threads were fabricated and assembled by textile techniques into yarns, 3D hierarchical constructs mimicking the fibrous architecture of native tendons fascicles. These yarns were based on a PCL matrix mechanically reinforced with cellulose nanocrystals (CNCs) decorated with superparamagnetic iron oxide nanoparticles (MNP@CNC). To simultaneously assure these particles chemical and colloidal stability and improve their interfacial compatibility with the polymer matrix, MNP@CNC were coated with thin layers of polydopamine that were further grafted with hydrophobic dodecanethiol (DT-NP). The incorporation of small amounts of DT-NP (0 – 5wt.%) significantly improved the mechanical properties of the nanofibre yarns, simultaneously endowing them with magnetic responsiveness. Moreover, the biological performance and functionality of the fabricated constructs, namely the capacity to induce tenogenic differentiation, was assessed by culturing human adipose stem cells (hASCs) under the influence or absence of magnetic stimulus. Magneto-mechanical stimulation of cells promoted high expression of tendon-related markers, such as Tenomodulin and Scleraxis, and activation of the YAP/TAZ signalling pathway, that regulates mechanotransduction. Moreover, cells under magneto-mechanical stimulation upregulated genes related with anti-inflammatory cytokines while downregulating pro-inflammatory factors. Overall, the nanofibre yarns were applied to create a magnetically responsive system that, combined with a tendon mimetic architecture, was able to mechanically stimulate cells. As result the proposed system boosted hASCs tenogenic commitment and synergistically had a positive effect on the modulation of their inflammatory response, both of which might play key roles to achieve on tendon regeneration.
Descrição
Tese de mestrado integrado em Engenharia Biomédica e Biofísica, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, em 2018
Palavras-chave
Tendão Partículas magnéticas Electrospinning Estrutura hierárquica Teses de mestrado - 2018