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Publicação
Grapevine-Plasmopara viticola Interactome : defining interacting partners through FRET-FLIM
| Nome: | Descrição: | Tamanho: | Formato: | |
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Resumo(s)
A videira (Vitis vinifera L.) é uma planta frutícola mundialmente cultivada, utilizada para vários fins,
incluindo a produção de vinho, o consumo de frutos frescos, frutos secos e a produção de sumos. Originalmente nativa da região mediterrânica, da Europa Central e da Ásia Menor, a videira é atualmente
cultivada em todo o mundo, com cerca de 7,3 milhões de hectares de área cultivada em 2022. A domesticação da videira começou há cerca de 7000-8000 anos, o que resultou numa diminuição da diversidade
genética nas suas populações e num aumento da suscetibilidade a doenças, como o míldio e o oídio. O
míldio da videira é causado pelo oomicete biotrófico obrigatório, Plasmopara viticola Berk. & M.A.
Curtis (Berl. & De Toni), capaz de infetar todas as partes verdes da videira e causar perdas significativas
nos rendimentos. Em condições favoráveis (temperatura elevada e humidade superior a 80%) e na presença de água, os zoósporos são libertados e deslocam-se para a superfície abaxial da folha. Os zoósporos formam uma hifa de penetração e um apressório para entrar no tecido vegetal, criando hifas e haustórios para extração de nutrientes e evasão de defesa por parte da planta. Esporângióforos são então
formados pelo menos cinco dias após a infeção, possuindo esporângios com zoósporos que são dispersos
em água na superfície abaxial da folha, dando início a infeções secundárias subsequentes (reprodução
assexuada). Em condições secas, o patógeno diferencia oósporos que sobrevivem ao inverno. Os sintomas da doença manifestam-se por lesões circulares e amareladas nas folhas (“oil spots”) e esporulação
branca na superfície abaxial da folha.
Para resistir aos numerosos agentes patogénicos, as plantas possuem um sistema imunitário complexo
para detetar e responder aos agentes patogénicos. O modelo zig-zag, proposto por Jones e Dangl em
2006, descreve as interações planta-patógeno como uma interação dinâmica. Esta interação envolve
recetores de reconhecimento (PRRs) que reconhecem padrões moleculares associados a micróbios ou
agentes patogénicos (MAMPs ou PAMPs). O reconhecimento bem sucedido desencadeia a PTI, que
pode impedir a colonização por agentes patogénicos. Os agentes patogénicos, por sua vez, segregam
moléculas efectoras para ultrapassar a PTI, conduzindo à ETS. A deteção das moléculas efectoras por
parte de recetores específicos da planta desencadeiam, por sua vez, a ETI, caracterizada por uma resposta
de defesa mais forte, incluindo espécies reativas de oxigénio (ROS) e influxo de cálcio. A ETI conduz
frequentemente a uma resposta hipersensível (HR), uma morte celular programada localizada eficaz
contra agentes patogénicos biotróficos.
Durante esta interação, são trocados vários sinais moleculares entre a planta e o agente patogénico, entre
as quais se encontram as proteases, proteínas responsáveis pela hidrólise de ligações peptídicas de outras
proteínas. Recentemente, a sua importância tem sido investigada no contexto das interações planta-patógeno, tendo-lhes sido atribuído um papel importante na PTI, ETI, HR e outras respostas imunitárias.
Adicionalmente, os agentes patogénicos libertam também proteases e inibidores de proteases a fim de
manipular a imunidade do hospedeiro e exercer a sua virulência sobre o mesmo. Por estes motivos,
aprofundar a compreensão dos mecanismos de ação de proteases é crucial no contexto da imunidade das
plantas.
As proteases estão divididas em várias classes, sendo as subtilases (SBT), proteases de serina, uma importante família de proteases em plantas. As SBTs contribuem para vários processos vegetais, incluindo
a embriogénese, o desenvolvimento das sementes, a morte celular programada e as respostas a stresses
bióticos e abióticos. Diferentes SBTs têm sido associadas a respostas imunes em diversas plantas, inclusive em videira na interação com P. viticola. Por exemplo, registou-se num cultivar tolerante de videira um aumento nos níveis de expressão do gene VviSBT4.19X1 após infeção por P. viticola, posteriormente, verificou-se também que esta era específica na resposta contra o P. viticola o que pode significar que esta proteína pode desempenhar um papel na imunidade. A compreensão dos mecanismos de
ação da VviSBT4.19 X1 pode contribuir para um conhecimento mais profundo da interação entre a
videira e o P. viticola. Para compreender o papel da VviSBT4.19 X1 na defesa da videira, é necessário identificar os seus
parceiros de interação. Utilizando um yeast-two-hybrid assay, foram identificados potenciais interactuantes. Estas proteínas incluem, uma proteína com um domínio de hélice (CHCH), um fator de transcrição (TCP11), a subunidade Pcc1 do complexo KEOPS/EKC (Pcc1), a subunidade 5 do complexo de
sinalização COP9 (CSN5) e a proteína relacionada com a autofagia (ATG8). Estas proteínas podem
estar envolvidas em vários aspetos da defesa das plantas.
Para validar estas interações, optou-se por utilizar a técnica de microscopia Föster resonance energy
transfer – fluorescence lifetime imaging microscopy (FRET-FLIM). O FRET-FLIM é uma técnica de
microscopia que consiste na medição da transferência de energia entre moléculas dadoras e aceitadoras
muito próximas (menos de 10 nm) e do tempo de vida da fluorescência de uma molécula. O FRETFLIM permite a avaliação das interações proteína-proteína e pode fornecer informações sobre a sua
dinâmica em tempo real. Esta técnica é valiosa para o estudo das interações entre plantas e agentes
patogénicos.
O principal objetivo deste projeto de tese de mestrado é investigar o papel da VviSBT4.19 X1 na imunidade da videira, identificando os seus interactuantes através de FRET-FLIM.
Para tal, várias otimizações do protocolo de clonagem para todas as proteínas foram necessárias. O
vector escolhido para o estudo de FRET-FLIM foi o pFRETgc-2in1-CC, pois foi descrito como sendo
bom para expressão transiente em plantas e para a realização de FRET-FLIM. As open reading frames
(ORF) de quatro possíveis interactuantes, TCP11, Pcc1, CSN5 e CHCH, foram clonados com sucesso
no vetor pFRETgc-2in1-CC e nos vetores controlo pFRET.C.NOS. Quanto ao ATG8, apenas foi possível clonar a sua ORF em pDONOR221, impossibilitando a continuação do seu estudo. Relativamente à
VviSBT4.19X1, e devido a desafios na sua clonagem no vector pFRET, o vector pGWB405 foi selecionado para a produção de proteína recombinante e estudos de localização subcelular, os resultados mostram que a clonagem foi também bem sucedida.
Para estudar a localização subcelular tanto da SBT como dos seus interactuantes, folhas de N. benthamiana infiltradas com os diversos vetores foram observadas ao microscópio de fluorescência. O TCP11
mostrou uma acumulação de fluorescência no núcleo e no espaço extracelular. O facto desta proteína
ser um factor de transcrição pode explicar a sua localização nuclear e a presença no espaço extracelular
pode ser explicada pelo facto de esta interagir com PRR. Quanto ao Pcc1, este apresentou um padrão de
fluorescência em forma de pontos espalhados pelo citoplasma, podendo representar vesículas, também
observamos fluorescência no núcleo e no espaço extracelular. Esta proteína está envolvida no metabolismo de tRNA, podendo explicar a presença em diferentes compartimentos celulares. Relativamente ao
CSN5, foi detetada fluorescência no citoplasma e no espaço extracelular, o que pode ser explicado devido ao envolvimento desta proteína na degradação de proteínas. Os padrões de fluorescência detetados
para CHCH demonstram localização no citoplasma, também com um padrão em pontos, possivelmente
indicando uma localização mitocondrial, foi também observado sinal de fluorescência no núcleo e no
espaço extracelular. Já os estudos preliminares quanto à localização da VviSBT4.19 X1 mostraram fluorescência no núcleo e no espaço extracelular. Foi também detetado um padrão pontilhado no citoplasma, o resultado de uma possível acumulação da SBT em vesículas. Curiosamente, apenas foi observada fluorescência aquando da co-infiltração da VviSBT4.19 X1 com um inibidor específico, o pVit26.
Estes dados revelam que VviSBT4.19X1 pode co-localizar no núcleo com TCP11, Pcc1 e CHCH e no
espaço extracelular com os quatro interactuantes. Sabe-se que as proteínas com domínio CHCH podem
estar envolvidas em vários processos na mitocôndria ligados a reações redox. Uma vez que a mitocôndria desempenha um papel fulcral na morte celular programada (PCD), associando-se também ao papel
biológico de ROS, é possível que CHCH esteja envolvida no estabelecimento da HR, um fenómeno de
PCD associado à resposta a patógenos. O papel de VviSBT4.19X1 pode consistir em contrariar a supressão da HR pelos agentes patogénicos, contribuindo assim para uma resposta imunitária mais robusta. A potencial interação entre VviSBT4.19X1 e TCP11 pode alterar a conformação deste fator de transcrição, influenciando a expressão de genes relacionados com a imunidade. A VviSBT4.19X1 também poderá facilitar a interação do TCP11 com PRRs e com o TCP15. A possível interação do Pcc1 e da
VviSBT4.19X1 pode refletir um envolvimento desta SBT em processos relativos ao metabolismo de
tRNA e de produção de proteínas. Finalmente a interação CSN5-VviSBT4.19X1 pode refletir um envolvimento desta proteína na degradação de proteínas e na resposta imunitária por ativação da via de
defesa por ácido jasmónico.
Todos estes resultados sugerem um papel importante da VviSBT4.19X1 durante as primeiras horas de
interação videira-P. viticola. No futuro, será essencial confirmar efetivamente a interação entre a
VviSBT4.19X1 e os seus interactuantes, bem como o significado biológico destas interações. Além
disso, será importante aferir o papel biológico do inibidor Pvit26 na virulência de P. viticola.
Grapevine is highly susceptible to downy mildew, caused by the oomycete Plasmopara viticola, a disease that can lead to severe losses in yield if left untreated. Currently, the most common treatments consist of fungicides, which pose a significant threat to the environment and to humans alike, raising the need for a continuous search for novel, more sustainable ways of disease control. One promising field of research in this interaction is the role of serine proteases termed subtilases, which have been found to play important roles in plant immunity, although their mechanisms of action remain elusive. In this work, we set out to validate the interacting partners of VviSBT4.19X1, a grapevine subtilase, initially identified via a yeast-two-hybrid assay, using fluorescence microscopy-based techniques. Fluorescence microscopy revealed putative subcellular localizations of these proteins, including the nucleus, cytoplasm, and extracellular space. TCP11 appeared to accumulate in the nucleus and extracellular space, while Pcc1 exhibited cytoplasmic and vesicular patterns, with mCherry signal also observed in the nucleus. CSN5 displayed cytoplasmic and extracellular signal. CHCH presented punctuated cytoplasmic fluorescence, likely indicating mitochondrial localization, with nuclear signal as well. VviSBT4.19X1 seems to display fluorescence in the nucleus and extracellular space, potentially colocalizing with interacting partners. Additionally, only the presence of the P. viticola serine protease inhibitor, Pvit26, enabled the visualization of VviSBT4.19X1. These findings suggest diverse roles for VviSBT4.19X1 in grapevine immunity, including potential involvement in transcriptional regulation, tRNA modification, and JA-mediated defence pathways. This is the first step for unravelling the mechanisms of action of this specific protein during immunity, with this we can develop grapevine varieties that are more resistant to disease, ensuring a sustainable and resilient future for viticulture.
Grapevine is highly susceptible to downy mildew, caused by the oomycete Plasmopara viticola, a disease that can lead to severe losses in yield if left untreated. Currently, the most common treatments consist of fungicides, which pose a significant threat to the environment and to humans alike, raising the need for a continuous search for novel, more sustainable ways of disease control. One promising field of research in this interaction is the role of serine proteases termed subtilases, which have been found to play important roles in plant immunity, although their mechanisms of action remain elusive. In this work, we set out to validate the interacting partners of VviSBT4.19X1, a grapevine subtilase, initially identified via a yeast-two-hybrid assay, using fluorescence microscopy-based techniques. Fluorescence microscopy revealed putative subcellular localizations of these proteins, including the nucleus, cytoplasm, and extracellular space. TCP11 appeared to accumulate in the nucleus and extracellular space, while Pcc1 exhibited cytoplasmic and vesicular patterns, with mCherry signal also observed in the nucleus. CSN5 displayed cytoplasmic and extracellular signal. CHCH presented punctuated cytoplasmic fluorescence, likely indicating mitochondrial localization, with nuclear signal as well. VviSBT4.19X1 seems to display fluorescence in the nucleus and extracellular space, potentially colocalizing with interacting partners. Additionally, only the presence of the P. viticola serine protease inhibitor, Pvit26, enabled the visualization of VviSBT4.19X1. These findings suggest diverse roles for VviSBT4.19X1 in grapevine immunity, including potential involvement in transcriptional regulation, tRNA modification, and JA-mediated defence pathways. This is the first step for unravelling the mechanisms of action of this specific protein during immunity, with this we can develop grapevine varieties that are more resistant to disease, ensuring a sustainable and resilient future for viticulture.
Descrição
Tese de Mestrado, Biologia Molecular e Genética , 2024, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências
Palavras-chave
Vitis vinifera Plasmopara viticola Subtilases Imunidade FRET-FLIM Teses de mestrado - 2024