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Publicação
Evaluation of the impact of the marine carotenoid astaxanthin on cadmium-induced toxic effects in human lung cells
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Autores
Resumo(s)
O cancro do pulmão (CP) é uma preocupação de saúde global em constante crescimento, impulsionada
por fatores como tabagismo, idade, género, localização geográfica e exposição ocupacional. É
classificado como o cancro mais letal em todo o mundo, especialmente devido aos diagnósticos em
estágios avançados. O tabagismo continua a ser a sua principal causa, sendo responsável por mais de
80% dos casos nos Estados Unidos. Estes fatores destacam a necessidade urgente de uma prevenção,
deteção precoce e tratamento do CP. O CP consiste em duas categorias principais: cancro do pulmão de
células não pequenas (CPCNP) e cancro do pulmão de células pequenas (CPCP), sendo o CPCNP o
mais prevalente. Os principais fatores de risco do CP envolvem fatores de estilo de vida como dieta e
obesidade, fumo de tabaco, uso de cigarros eletrónicos e exposições ambientais a substâncias como o
rádon, amianto e poluição do ar. A exposição ocupacional a várias substâncias químicas e metais
aumenta o risco de CP.
Cádmio (Cd), um metal pesado, apresenta riscos significativos para a saúde, incluindo o aumento do
risco de desenvolver CP. A exposição ao Cd ocorre por inalação em ambientes de trabalho e consumo
de alimentos contaminados. Os mecanismos tóxicos incluem lesões no DNA, stress oxidativo,
inflamação, disfunção mitocondrial e interferência na reparação do DNA. O Cd é classificado como
cancerígeno para o Homem, pertencendo ao Grupo 1 na classificação da Internacional Agency for
Research on Cancer (IARC). Vários compostos têm mostrado ser promissores na mitigação da
toxicidade geral e genotoxicidade induzida pelo Cd, embora seja importante que esta área de
investigação seja reforçada.
A astaxantina (ATX), um carotenoide, é um potente antioxidante produzido principalmente por
microalgas e usada para conferir a coloração vermelha-rosa aos animais de aquacultura. Além do seu
papel de corante, a ATX apresenta propriedades antioxidantes notáveis, consideradas potencialmente
100-500 vezes mais fortes do que a vitamina E. A ATX tem sido extensivamente estudada pelos seus
potenciais benefícios para a saúde, incluindo efeitos promissores em várias doenças pulmonares. ATX
exibe propriedades anticancerígenas potentes atribuídas à sua capacidade de combater o stress oxidativo,
um fator comum no desenvolvimento do cancro. Neste contexto, a compreensão dos diversos aspetos
do CP induzido pelo Cd e a avaliação do potencial da ATX na sua prevenção torna-se muito importante
para a mitigação deste problema de saúde global.
Este estudo concentra-se na investigação do impacto do Cd nas células pulmonares (H1975 e BEAS2B), com ênfase particular no seu papel no aumento da proliferação celular, alterações metabólicas, e
aumento do stress oxidativo via espécies reativas de oxigénio (ROS). Além disso, o presente estudo visa
examinar as capacidades migratórias das células H1975 sob exposição ao Cd e investigar se a ATX
poderá contrariar os efeitos pró-migratórios induzidos pelo Cd. Os modelos celulares selecionados
tentam mimetizar os efeitos do Cd tanto em tecido saudável como em tecido de cancro, fornecendo
informações sobre o potencial papel protetor da ATX in vitro.
A viabilidade celular foi avaliada em ambas as linhas celulares, recorrendo ao ensaio do cristal violeta
(CV) e de redução de MTS após 72 horas de exposição ao Cd. Os resultados indicaram um decréscimo
da viabilidade celular dependente da concentração de Cd. Foram testadas concentrações de Cd entre
0.5-140 µM nas células H1975 e 5-50 µM nas células BEAS-2B. Os valores de IC50 calculados foram
de 105,6 µM para o ensaio de CV e 110,7 µM para o ensaio de MTS nas células H1975, e de 38,2 µM
para o ensaio de CV e 45,2 µM para o ensaio de MTS nas células BEAS-2B. Estes resultados mostram
que as células BEAS-2B são consideravelmente mais sensíveis à citotoxicidade induzida pelo Cd em
comparação com as células H1975. Para avaliar a viabilidade celular da ATX, procedeu-se de igual
modo em ambas as linhas celulares. A viabilidade manteve-se inalterada em todas as concentrações de
ATX (1-20 µM) após 72 horas de encubação.
Para avaliar o impacto do tratamento com ATX em células pulmonares não tumorais expostas a Cd, foi
realizada uma co-incubação recorrendo às células BEAS-2B por um período de 72 horas. Os efeitos foram avaliados através do ensaio do CV. A ATX não levou a nenhuma alteração com significado
estatístico da citotoxicidade induzida pelo Cd per se para todas as concentrações testadas.
Sendo as metástases responsáveis por mais de 90% das mortes relacionadas com o CP, avaliou-se a
capacidade migratória das células cancerosas. Após a identificação de concentrações não citotóxicas de
Cd, através de uma incubação de 32 horas em meio de cultura com 2% FBS com diferentes
concentrações de Cd, foi realizado o denominado ensaio da ferida. A exposição ao Cd levou a um
aumento da migração celular com significado estatístico para todas as concentrações, exceto 5 µM.
Após 20 horas, a migração celular aumentou em 18% (p < 0,05), 33% (p < 0,001) e 35% (p < 0,001)
para concentrações de Cd de 0.5 µM, 1 µM e 10 µM, respetivamente. A avaliação às 24 horas exibiu
uma tendência semelhante, com um aumento na migração de 17% (p < 0,05), 31% (p < 0,001) e 33% (p
< 0,001) para as mesmas concentrações. Às 32 horas, a significância estatística foi mantida para
concentrações de 1 µM e 10 µM, mostrando um aumento de 22% (p < 0,01) e 26% (p < 0,01) na
migração celular, respetivamente, evidenciando o efeito pró-migratório do Cd nestas células.
Para avaliar o perfil metabólico de ambas as linhas celulares foi realizada uma analise de metabolómica
preliminar, avaliando, neste caso, o endometaboloma em células expostas ao Cd (1 μM -10 μM). Nesta
primeira abordagem ao estudo global do metaboloma, que se encontra ainda a ser finalizado, recorrendo
a outras metodologias analíticas e à análise do exometaboloma, não foi possível verificar alterações
significativas no perfil metabólico nas concentrações testadas.
Um dos mecanismos de toxicidade de Cd é a produção de espécies reativas de oxigénio (ROS) e a
presença de stress oxidativo após a exposição a este metal. Este fenómeno provoca lesões no DNA,
peroxidação lipídica, desregulação dos mecanismos de defesas antioxidantes, assim como a ativação de
vias de sinalização sensíveis ao stresse oxidativo. Ambas as linhas celulares foram expostas a
concentrações crescentes de Cd (1 µM -10 µM). O nível de ROS aumentou de uma forma marcada em
ambas as linhas celulares para a concentração de 10 µM. Nas células H1975 houve um aumento de ROS
de cerca de 1.3 vezes (p < 0,001), e 7.3 vezes (p < 0,0001) para as concentrações de 5 µM e 10 µM
respetivamente. Nas células BEAS-2B, a concentração de Cd de 10 µM aumentou os níveis de ROS em
6.7 vezes (p < 0,0001), não sendo significativos os aumentos observados com concentrações inferiores.
Para avaliar os efeitos combinatórios da ATX (20 µM) em células expostas ao Cd (1 µM e 10 µM) em
termos de migração celular, procedeu-se do mesmo modo descrito no ensaio de migração anteriormente
mencionado. Verificou-se que nenhuma das combinações testadas de Cd ou ATX exibiu efeitos
citotóxicos (ensaio do CV). De seguida avaliou-se a capacidade migratória através do ensaio da ferida.
Os resultados obtidos sugerem que a ATX contraria de uma forma consistente o efeito induzido pelo Cd
na migração celular coletiva. Após 20 horas, o Cd (1 µM) aumentou a migração celular em 16% (p <
0,01), enquanto na concentração de 10 µM aumentou a migração em 23% (p < 0,001) em comparação
com o controlo. A combinação de ATX (20 µM) com Cd reverteu a capacidade de migração para níveis
basais encontrados nas células controlo não tratadas. Resultados semelhantes foram observados às 24
horas. O Cd na concentração de 1 e 10 µM levou a um aumento da migração celular em 14% (p < 0,01)
e 18% (p < 0,001), respetivamente. A combinação de ATX (20 µM) com Cd reverteu eficazmente a
migração celular para os níveis das células controlo. Estes resultados indicam que a ATX tem capacidade
de mitigar o efeito pró-migratório induzido pelo Cd, sendo este um achado muito importante da presente
dissertação.
Em resumo, este estudo investigou o impacto do Cd nas células pulmonares, com foco na viabilidade
celular, geração de ROS, migração celular e metaboloma. O estudo revelou que o Cd induziu um
aumento na migração celular das células H1975, indicando um potencial pró-migratório deste metal em
células de CPCNP. Além disso, a exposição ao Cd resultou num aumento de produção significativa de
ROS. Por seu lado, a ATX, contrariou eficazmente o efeito pró-migratório do Cd, restaurando para
níveis basais a migração celular. Estes resultados destacam o potencial da ATX como uma potencial
estratégia terapêutica para mitigar os efeitos adversos do Cd em células de CPCNP. Esta linha de investigação deverá ser mais aprofundada em estudos adicionais de modo a contribuir para uma
compreensão mais aprofundada dos mecanismos subjacentes aos efeitos tóxicos do Cd nas células
pulmonares e fornecer mais dados que suportem o papel benéfico da ATX.
Cadmium (Cd) is a metal contaminant arising from natural and human activities. Human Cd exposure occurs through various channels namely occupational settings, contaminated food and water, and cigarette smoke. Cd is linked to lung cancer (LC), particularly non-small cell lung cancer (NSCLC), the most prevalent subtype. Recognized as a human carcinogen, comprehending the role of Cd in carcinogenesis and tumor progression is crucial. Astaxanthin (ATX) belongs to the family of xanthophylls classified as carotenoids. Besides its industrial use in aquaculture, ATX is a potent antioxidant used as a human dietary supplement. ATX exhibits promising results in preventing cancer, boosting immunity, and in other diseases like asthma, COPD, and lung fibrosis. This study investigates the effect of Cd (CdCl2), alone or in combination with ATX, in human NSCLC cells (H1975) and nonmalignant lung cells (BEAS-2B). This work also evaluates the impact of ATX in the mitigation of Cdinduced toxic effects. The endpoints selected encompass cell viability, migration, ROS levels, and metabolomics. Cytotoxic effects of Cd and ATX in H1975 cells and BEAS-2B cells were evaluated by crystal violet staining assay and the MTS reduction assay. The results showed that Cd is cytotoxic, albeit only at high concentrations, with greater impact on non-malignant cells, while ATX, revealed no cytotoxicity. Cd increased ROS production across both cell lines in a concentration-dependent manner. A preliminary metabolome analysis on both cell lines yielded no significant results. Non-cytotoxic concentrations of Cd and ATX were selected to perform the wound-healing assay in H1975 cells. Cd was able to increase the collective cell migration and co-incubation with ATX was able to revert the Cdinduced cancer cell migration. Overall, Cd exhibits cytotoxicity in lung cells, with differing sensitivity between non-malignant and malignant cells. Importantly, it promotes NSCLC cell migration, which is ameliorated by ATX and increases ROS production.
Cadmium (Cd) is a metal contaminant arising from natural and human activities. Human Cd exposure occurs through various channels namely occupational settings, contaminated food and water, and cigarette smoke. Cd is linked to lung cancer (LC), particularly non-small cell lung cancer (NSCLC), the most prevalent subtype. Recognized as a human carcinogen, comprehending the role of Cd in carcinogenesis and tumor progression is crucial. Astaxanthin (ATX) belongs to the family of xanthophylls classified as carotenoids. Besides its industrial use in aquaculture, ATX is a potent antioxidant used as a human dietary supplement. ATX exhibits promising results in preventing cancer, boosting immunity, and in other diseases like asthma, COPD, and lung fibrosis. This study investigates the effect of Cd (CdCl2), alone or in combination with ATX, in human NSCLC cells (H1975) and nonmalignant lung cells (BEAS-2B). This work also evaluates the impact of ATX in the mitigation of Cdinduced toxic effects. The endpoints selected encompass cell viability, migration, ROS levels, and metabolomics. Cytotoxic effects of Cd and ATX in H1975 cells and BEAS-2B cells were evaluated by crystal violet staining assay and the MTS reduction assay. The results showed that Cd is cytotoxic, albeit only at high concentrations, with greater impact on non-malignant cells, while ATX, revealed no cytotoxicity. Cd increased ROS production across both cell lines in a concentration-dependent manner. A preliminary metabolome analysis on both cell lines yielded no significant results. Non-cytotoxic concentrations of Cd and ATX were selected to perform the wound-healing assay in H1975 cells. Cd was able to increase the collective cell migration and co-incubation with ATX was able to revert the Cdinduced cancer cell migration. Overall, Cd exhibits cytotoxicity in lung cells, with differing sensitivity between non-malignant and malignant cells. Importantly, it promotes NSCLC cell migration, which is ameliorated by ATX and increases ROS production.
Descrição
Tese de Mestrado, Biologia Humana e Ambiente, 2024, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências
Palavras-chave
Cancro do Pulmão de Células Não Pequenas Células Epiteliais Pulmonares Cádmio Citotoxicidade Astaxantina Teses de mestrado - 2024