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Publicação
Exploring the role of metabolism in the differentiation and maturation of human pluripotent stem cell derived cardiomyocytes
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Autores
Resumo(s)
Atualmente, e apesar dos grandes avanços na medicina, as doenças cardiovasculares continuam a ser a principal causa de morte a nível mundial. Muitas destas doenças, como por exemplo o enfarte do miocárdio, estão associadas a uma grande perda permanente de cardiomiócitos, uma população celular não proliferativa e terminalmente diferenciada. Assim, dos tratamentos existentes apenas o transplante cardíaco permite compensar tanto a perda celular como restaurar de forma eficiente a função cardíaca. No entanto, a implementação desta intervenção cirúrgica como tratamento convencional é restringida pelo número limitado de órgãos compatíveis doados.
A capacidade de proliferação ilimitada das células estaminais pluripotentes humanas (hPSC do acrónimo inglês human pluripotent stem cell), em conjunto com protocolos de diferenciação direcionada eficientes, permitem a produção de vários tipos específicos de células humanas, incluindo cardiomiócitos. Estas células podem ser usadas numa vasta panóplia de aplicações tal como, medicina regenerativa, rastreio de novos medicamentos ou como modelo celular para avaliar o desenvolvimento e progressão de várias doenças. Apesar do progresso alcançado ao longo dos anos no aumento da eficiência dos protocolos de diferenciação, a população final de cardiomiócitos derivados de hPSC (hPSC-CMs) obtida apresenta um fenótipo imaturo quer em termos de estrutura, expressão génica, metabolismo ou electrofisiologia. Por isto, o estado imaturo dos hPSC-CMs é atualmente o principal fator a limitar o potencial destas células em terapia celular e investigação pré-clinica.
Portanto, o objetivo deste estudo centra-se na avaliação do impacto da alteração da composição do meio de cultura dos hPSC-CMs, por forma a mimetizar os substratos disponíveis durante o desenvolvimento in vivo do coração humano, na maturação de hPSC-CMs in vitro.
Duas linhas de células estaminais, uma de células estaminais embrionárias humanas (hESC) e outra de hPSC induzidas (hiPSC), foram diferenciadas usando um protocolo recentemente implementado para a diferenciação direcionada de cardiomiócitos em mono-camadas bidimensionais. Análise por citometria de fluxo permitiu garantir a eficiência da metodologia aplicada assim como determinar a pureza da população de cardiomiócitos obtida. Adicionalmente, análise qualitativa do proteoma total de ambas as linhas de células estaminais, antes e após diferenciação, revelou um enriquecimento significativo, em funções biológicas relacionadas com a função cardíaca, após 15 dias de diferenciação. Por outro lado, a análise das principais vias metabólicas mostrou um enriquecimento acentuado em vias como fosforilação oxidativa, ciclo do TCA, glicólise e β-oxidação de ácidos gordos, após 15 dias de diferenciação. A análise destes resultados revela que durante a diferenciação de células estaminais para uma linhagem cardíaca existe um desenvolvimento em termos de maquinaria metabólica oxidativa, apesar de tanto as hPSC como os hPSC-CMs se manterem principalmente glicolíticos. Deste modo procedeu-se com um estudo metabólico detalhado para avaliar a possível existência de uma relação entre a fonte de carbono disponível no meio de cultura e o perfil metabólico das células.
Após 15 dias de diferenciação, hiPSC-CMs foram mantidos durante mais 20 dias em meio de cultura sem glucose mas suplementado quer com: i) ácidos gordos (FAM), ii) galactose e ácidos gordos (GFAM), iii) lactato durante os primeiros 10 dias seguido de uma troca para galactose e ácidos gordos durante o restante tempo em cultura (LACM&GFAM), além da condição controlo em meio rico em glucose (GLCM). Várias técnicas de metabolómica como HPLC e GC-MS, assim como análise estrutural recorrendo a microscopia de imunofluorescência, foram usadas ao longo da cultura, para avaliar o impacto do uso de fontes de carbono distintas no perfil metabólico e estrutural de hiPSC-CMs.
Uma primeira análise dos dados metabólicos confirmou que hiPSC-CMs em GLCM, mantêm um perfil metabólico dependente de glicólise anaeróbica sem qualquer melhoria na capacidade oxidativa ao longo do tempo em cultura. Este resultado foi comprovado pela taxa de produção de lactato elevada, do qual cerca de 90% advém da metabolização de glucose, e pela fração inalterada de incorporação em intermediários do ciclo do TCA. No entanto, na ausência de glucose, hiPSC-CMs demonstraram uma plasticidade metabólica notável ao consumirem as fontes de carbono distintas suplementadas no meio. Por outro lado, nestes meios sem glucose não se verifica a dependência de glicólise anaeróbica, visto que em nenhuma destas condições houve produção de lactato. Estes resultados sugerem que quando o principal substrato disponível no meio de cultura é glucose, o consumo preferencial deste substrato restringe os hiPSC-CMs a um metabolismo glicolítico. Portanto, o desenvolvimento em termos de maquinaria metabólica durante a diferenciação de hiPSC-CMs, verificado através da análise do proteoma total, poderá refletir uma adaptação inerente dos hiPSC-CMs para o consumo de diversas fontes de carbono e transição para um metabolismo oxidativo.
Para uma caracterização mais detalhada das alterações metabólicas em hiPSC-CMs, as taxas de consumo e produção de metabolitos assim como os dados de incorporação de isótopos 13C foram integrados num modelo da rede metabólica celular, através de 13C-MFA não estacionário. Esta técnica baseia-se no recurso a simulação computacional para estimar um conjunto de fluxos metabólicos intracelulares que minimizem a variância da soma dos quadrados dos resíduos entre os valores previstos pelo modelo e os medidos experimentalmente. Os modelos metabólicos obtidos ao final do tempo de cultura confirmam os resultados preliminares, de que: i) em GLCM, os hiPSC-CMs permanecem principalmente glicolíticos, no qual a maior parte do piruvato citosólico é desviado para a produção de lactato; ii) nas restantes condições se verifica a transição para um metabolismo oxidativo, com um aumento significativo na contribuição do ciclo de TCA e da β-oxidação de ácidos gordos. Todavia, em FAM, a maior parte dos ácidos gordos que entram na célula são desviados para acumulação nas reservas internas (gotículas lipídicas). Um resultado confirmado com recurso a um kit comercial para a quantificação destas reservas, o que justifica a baixa viabilidade observada nas células cultivadas neste meio dado o efeito tóxico da acumulação excessiva de lípidos.
Da seleção de diferentes meios testados, a cultura em meio suplementado com galactose e ácidos gordos (GFAM) provou ser a mais eficiente a promover a maturação de hiPSC-CMs in vitro. Aqui, os hiPSC-CMs além de serem caracterizados por um perfil metabólico principalmente oxidativo apresentam também uma morfologia alongada e estruturas sarcoméricas com um elevado nível de organização. Todos estes fatores referidos são característicos de cardiomiócitos humanos adultos. Adicionalmente, a presença de galactose melhorou a oxidação de ácidos gordos ao aumentar a capacidade oxidativa total, prevenindo desta forma os efeitos tóxicos da acumulação de lípidos. Pelo contrário, os hiPSC-CMs mantidos na condição controlo, ou seja em meio rico em glucose (GLCM), apresentam um metabolismo glicolítico, tal como cardiomiócitos fetais, além de que possuem uma morfologia arredondada, área celular maior e sarcómeros desorganizados, estando todas estas características associadas a hipertrofia patológica. Estes resultados evidenciam a importância do papel regulatório do metabolismo numa variedade ampla de funções celulares.
Neste estudo é reportado pela primeira vez um modelo da rede metabólica de hiPSC-CMs cultivados com distintas fontes de carbono, obtido através de 13C-MFA não estacionário, assim como, é explorado o nível ao qual esta mudança na disponibilidade de substratos regula a maturação metabólica e estrutural dos hiPSC-CMs. O protocolo de maturação estabelecido neste estudo apresenta vantagens técnicas e económicas em relação às abordagens existentes, dada a sua simplicidade (uma simples mudança de meio de cultura) e facilidade de aplicação (não requer equipamento específico ou adição de fatores/químicos caros). De notar que, 10 dias de cultura em GFAM foi suficiente para promover um nível de maturação metabólica e estrutural dos hiPSC-CMs comparável ao que tem sido reportado na literatura em culturas de longo prazo. No cômputo geral, a metodologia aqui desenvolvida constitui um avanço relevante no desenvolvimento de estratégias eficientes de maturação de hiPSC-CMs, facilitando a transferência de hiPSC-CMs para aplicações em terapia celular, testes de toxicidade, descoberta de novos medicamentos e modelos celulares de doenças cardíacas.
The immature phenotype of human pluripotent stem cell derived cardiomyocytes (hPSC-CM) is currently the main drawback limiting the potential of these cells for applications in cell therapy and pre-clinical research. Herein, it was assessed whether alteration of hPSC-CM culture medium composition to mimic in vivo substrate availability during cardiac development would induce hPSC-CM maturation in vitro. Initial qualitative proteomic characterization of both stem cell and differentiated cultures revealed that although hPSC-CMs remain highly glycolytic, like their pluripotent counterparts, there is an evident development in oxidative metabolic machinery, together with enrichment in cardiac markers, during differentiation to a cardiac lineage. Parallel labeling experiments and 13C-MFA were used for the estimation of intracellular flux distributions, which coupled with structural analysis allowed to elucidate the impact of distinct carbon sources in the metabolic profile and maturation status of hiPSC-CMs. Culture of hiPSC-CMs in media with distinct carbon sources (glucose, lactate, fatty acids and galactose) proved that hiPSC-CMs exhibit remarkable metabolic plasticity, being able to shift to an oxidative metabolism, in the absence of glucose. From the assorted selection of media tested, cell culture in fatty acid medium supplemented with galactose was the most efficient in improving hiPSC-CMs maturation, as cells display an oxidative metabolism and show an elongated morphology with highly organized sarcomeric structures. Furthermore, galactose improved fatty acid oxidation by increasing oxidative capacity thus preventing lipotoxic effects of fatty acid accumulation. In standard glucose rich medium, hiPSC-CMs maintain a fetal-like metabolic profile and display features that resemble pathogenic hypertrophy. This thesis reports for the first time not only a metabolic network model of hiPSC-CMs cultured in distinct media, but also important insights on how substrate change modulates metabolic and structural maturation of hiPSC-CMs. As such, this work represents a relevant step forward in time efficient maturation of hiPSC-CMs, facilitating the use of this promising cell type in clinical and pre-clinical applications.
The immature phenotype of human pluripotent stem cell derived cardiomyocytes (hPSC-CM) is currently the main drawback limiting the potential of these cells for applications in cell therapy and pre-clinical research. Herein, it was assessed whether alteration of hPSC-CM culture medium composition to mimic in vivo substrate availability during cardiac development would induce hPSC-CM maturation in vitro. Initial qualitative proteomic characterization of both stem cell and differentiated cultures revealed that although hPSC-CMs remain highly glycolytic, like their pluripotent counterparts, there is an evident development in oxidative metabolic machinery, together with enrichment in cardiac markers, during differentiation to a cardiac lineage. Parallel labeling experiments and 13C-MFA were used for the estimation of intracellular flux distributions, which coupled with structural analysis allowed to elucidate the impact of distinct carbon sources in the metabolic profile and maturation status of hiPSC-CMs. Culture of hiPSC-CMs in media with distinct carbon sources (glucose, lactate, fatty acids and galactose) proved that hiPSC-CMs exhibit remarkable metabolic plasticity, being able to shift to an oxidative metabolism, in the absence of glucose. From the assorted selection of media tested, cell culture in fatty acid medium supplemented with galactose was the most efficient in improving hiPSC-CMs maturation, as cells display an oxidative metabolism and show an elongated morphology with highly organized sarcomeric structures. Furthermore, galactose improved fatty acid oxidation by increasing oxidative capacity thus preventing lipotoxic effects of fatty acid accumulation. In standard glucose rich medium, hiPSC-CMs maintain a fetal-like metabolic profile and display features that resemble pathogenic hypertrophy. This thesis reports for the first time not only a metabolic network model of hiPSC-CMs cultured in distinct media, but also important insights on how substrate change modulates metabolic and structural maturation of hiPSC-CMs. As such, this work represents a relevant step forward in time efficient maturation of hiPSC-CMs, facilitating the use of this promising cell type in clinical and pre-clinical applications.
Descrição
Tese de mestrado em Biologia Molecular e Genética, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2016
Palavras-chave
Cardiomiócitos derivados de células estaminais pluripotentes humanas (hPSC-CMs) Maturação de cardiomiócitos Ácidos gordos Galactose Análise de fluxo metabólico Teses de mestrado - 2016