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Energy metabolism and drug interactions in liver function
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Resumo(s)
O fígado é um órgão fundamental para diversos processos fisiológicos, incluindo a biotransformação de muitos fármacos. O metabolismo mitocondrial depende de processos regulatórios complexos para satisfazer as necessidades energéticas da célula. O papel da disfunção mitocondrial como base fundamental dos efeitos iatrogénicos induzidos por determinados fármacos constitui o âmbito da presente investigação.
O complexo piruvato desidrogenase (PDC) é uma das proteínas multiméricas maiores e mais complexas que representa um papel principal no metabolismo energético. Este complexo é responsável pela formação de acetil-CoA, um metabolito de sinalização na interface de vias cruciais. Devido à sua relevância, a regulação do PDC tem sido amplamente estudada. Este complexo é composto por quatro subunidades catalíticas distintas: piruvato desidrogenase (E1/PDH), dihidrolipoamida transacetilase (E2/DLAT), dihidrolipoamida desidrogenase (E3/DLD) e a proteína de ligação a E3 (E3BP). É importante destacar que a E3 para além de fazer parte do PDC também se encontra envolvida noutros quatro complexos mitocondriais: o complexo a-cetoglutarato desidrogenase, a-cetoácido desidrogenase de cadeia ramificada, a-cetoadipato desidrogenase e glicina descarboxilase. Portanto, inferimos que qualquer efeito associado a um fármaco que afecte a subunidade E3 e/ou na atividade do PDC pode induzir efeitos pleiotrópicos em células e tecidos. Relativamente à localização do PDC foi considerada durante anos como estritamente mitocondrial. Mas, curiosamente, a sua presença e função no núcleo foram demonstradas, produzindo acetil-CoA, um substrato para a acetilação de histonas. A translocação dinâmica do PDC mitocondrial para o núcleo liga o metabolismo e a epigenética, uma via determinante para a homeostase energética.
O ácido valpróico (VPA) é um fármaco antiepilético usado mundialmente que tem sido reconhecido como um potencial indutor de teratogenicidade ou toxicidade hepática leve a severa, na qual os mecanismos subjacentes ainda não são totalmente compreendidos. Este fármaco também tem sido reconhecido como um inibidor da desacetilase de lisina em proteínas (KDACi), que está relacionado com as suas propriedades anticancerígenas. A nível molecular, este fármaco é um ácido gordo de cadeia ramificada que é capaz de desencadear efeitos significativos no metabolismo energético. A demonstração da formação do valproil-Coenzima A (valproil-CoA, VP-CoA), a interação com a via oxidativa de aminoácidos de cadeia ramificada, a potencial interferência com o transporte do piruvato e com a taxa de oxidação do piruvato fornecem evidencias inequívocas de que este fármaco tem efeitos importantes no metabolismo celular. Nas últimas décadas, diversos estudos demostraram uma disfunção mitocondrial potencialmente associada ao VPA com efeitos na oxidação do piruvato, a-cetoglutarato ou cetoácidos de cadeia ramificada in vitro e no metabolismo da glicina in vivo. E ainda, os efeitos inibitórios do VPA na oxidação do piruvato e do a-cetoglutarato em mitocôndrias de fígado de rato foram relacionados à inibição de E3. Com efeito, em presença de certos substratos respiratórios demonstrou-se que o VPA pode comprometer a função mitocondrial, diminuindo o consumo de oxigénio e a síntese de ATP. Este efeito inibidor sobre a fosforilação oxidativa era claro quando a respiração mitocondrial era sustentada por piruvato e glutamato, não sendo observado em presença de succinato.
Com base nos dados disponíveis, coloca-se a hipótese de os efeitos moleculares induzidos pelo VPA poderem associar-se a uma interação com a subunidade E3. Assim um dos objetivos específicos do presente trabalho é precisamente investigar se o principal metabolito mitocondrial do VPA pode induzir a inibição da subunidade E3 do PDC que por sua vez, pode ter impacto na formação de acetil-CoA e no fluxo de metabolitos através do ciclo do ácido tricarboxílico (TCA). De igual modo postulamos que as alterações induzidas por fármacos no PDC (ou E3) no núcleo possam estar relacionadas com a atividade KDAC e com o estado de acetilação das histonas. Para investigar estas hipóteses foi utilizado tecido hepático, lisados mitocondriais e alíquotas de urina de ratos Wistar expostos ao VPA com o objetivo de elucidar os mecanismos induzidos pelo fármaco na toxicidade hepática. O plano experimental tem como objetivos: i) elucidar os efeitos induzidos pelo VPA nos perfis dos metabolitos, nomeadamente no ciclo do TCA, pelo que pretendemos analisar ácidos orgânicos em amostras de urina; ii) esclarecer se o VPA in vivo pode contribuir para a inibição da subunidade E3 usando mitocôndrias de fígado de rato; iii) esclarecer os mecanismos da atividade inibitória mediada pelo VPA na desacetilação de histonas; iv) analisar frações subcelulares incluindo núcleos de amostras tratadas com VPA, a fim de identificar a presença de PDC, mais especificamente da subunidade E3, bem como proteínas acetiladas e respetiva expressão diferencial; v) contribuir com uma análise integrada (atividade enzimática, análise de metabolitos e níveis de proteína) para elucidar os efeitos associados ao VPA na subunidade E3 e o respetivo impacto sobre os diferentes complexos nos quais esta participa. Para investigar estas hipóteses foram analisados perfis de ácidos orgânicos, por cromatografia gasosa-espectrometria de massa (GC-MS), em alíquotas de urina de ratos Wistar expostos ao VPA. Além disso, também se sintetizou o principal metabolito mitocondrial do fármaco, valproil-CoA, para ser testado in vitro como um potencial inibidor da atividade da E3. Para tal, foram realizados estudos cinéticos por ensaios espectrofotométricos com a enzima purificada. Os resultados obtidos sugerem o comportamento alostérico típico da enzima E3, já previamente reportado em dois diferentes organismos: Acidianus ambivalens e Corynebacterium glutamicum.
Os dados obtidos de cinética enzimática demonstraram que VP-CoA inibe claramente a atividade de E3 in vitro, determinada no sentido reverso (taxa de oxidação de NADH). Um efeito inibitório semelhante na atividade da E3 foi confirmado usando lisados mitocondriais de fígado de ratos expostos ao VPA (in vivo) em relação aos respectivos controlo não expostos ao fármaco. Além disso, os níveis urinários de intermediários do ciclo do TCA (nomeadamente o ácido fumárico, málico, cis-aconítico, cítrico e isocítrico) mostraram ser claramente modificados com a administração do fármaco, onde foi observado uma diminuição da excreção nos níveis dos ácidos succínico, a-cetoglutárico e a-cetoadípico associada ao VPA. Foi também demonstrado um aumento da excreção de ácido láctico, nomeadamente na dose mais elevada de VPA.
Portanto, podemos afirmar que os mecanismos de inibição da oxidação do piruvato associados a este fármaco são múltiplos e não totalmente esclarecidos. A relevância do VPA, com um espectro crescente de reivindicações farmacológicas, como antiepilético, anticonvulsivo, agente estabilizador do humor ou coadjuvante em esquemas combinatórios anticancerígenos, é indiscutível. No entanto, demonstrou desencadear hepatotoxicidade ou teratogenicidade potencial, onde o seu papel como um KDACi reconhecido não está totalmente elucidado.
Como conclusão, estes estudos demonstram que a formação de valproil-CoA tem um papel relevante nos mecanismos de disfunção do metabolismo energético mitocondrial, nomeadamente através da inibição da atividade de E3. O comprometimento dos complexos enzimáticos associados à subunidade E3 e a dependência intrincada dos níveis de NAD+/NADH podem desempenhar um papel central na patogénese da toxicidade hepática induzida por fármacos.
The liver is a critical organ for several physiological processes, including the biotransformation of drugs. Valproic acid (VPA) is a worldwide used antiepileptic drug that may potentially cause teratogenicity or a mild to severe hepatic toxicity, where the underlying mechanisms are still poorly understood. This drug has also been recognized as a lysine deacetylases inhibitor (KDACi), which is related to its anti-cancer properties. Numerous reports demonstrate a mitochondrial dysfunction associated with VPA with effects on pyruvate, a-ketoglutarate or branched-chain keto acids oxidation in vitro and on glycine metabolism in vivo. Pyruvate dehydrogenase (PDC) is a large multimeric complex that defines the formation of acetyl-CoA, representing a central hub for energy metabolism. The present work focuses on dihydrolipoamide dehydrogenase (E3), a key component not only of PDC, but also of a-ketoglutarate dehydrogenase, branched-chain a-keto acid dehydrogenase, a-ketoadipate dehydrogenase and the glycine decarboxylase complexes. Two central hypotheses prompted experimental studies. First, it is proposed that VPA may induce inhibition of E3 subunit of PDC that can impact on acetyl-CoA formation and on the flux of metabolites through tricarboxylic acid (TCA) cycle. Second, it is postulated that drug-induced alterations on PDC (or E3) in the nucleus may be related to KDAC activity and with histone acetylation status. In order to investigate these hypotheses, we analyzed organic acids profiles, by GC-MS in urine aliquots of Wistar rats exposed to VPA. In addition, we synthesized the major mitochondrial drug metabolite, valproyl-CoA (VP-CoA), to be tested in vitro as potential inhibitor of E3 activity. To this aim, a spectrophotometric assay was set up and kinetic studies were performed using purified enzyme. Overall results show that VP-CoA clearly inhibits E3 activity in vitro, measured on the reverse direction (rate of NADH oxidation). A similar inhibitory effect of E3 activity was confirmed using liver mitochondrial lysates from rats exposed to VPA (in vivo). Moreover, the urinary levels of intermediates of TCA cycle are shown to be clearly modified with drug administration where an increased excretion of lactic acid associated with VPA was observed. In conclusion, these studies demonstrate that VPA interferes with mitochondrial energy metabolism through multiple mechanisms including a VP-CoA induced inhibition of E3 activity. The impairment of E3-associated complexes and intricate dependence from NAD+/NADH levels may play a pivotal role in pathogenesis of drug-induced liver toxicity.
The liver is a critical organ for several physiological processes, including the biotransformation of drugs. Valproic acid (VPA) is a worldwide used antiepileptic drug that may potentially cause teratogenicity or a mild to severe hepatic toxicity, where the underlying mechanisms are still poorly understood. This drug has also been recognized as a lysine deacetylases inhibitor (KDACi), which is related to its anti-cancer properties. Numerous reports demonstrate a mitochondrial dysfunction associated with VPA with effects on pyruvate, a-ketoglutarate or branched-chain keto acids oxidation in vitro and on glycine metabolism in vivo. Pyruvate dehydrogenase (PDC) is a large multimeric complex that defines the formation of acetyl-CoA, representing a central hub for energy metabolism. The present work focuses on dihydrolipoamide dehydrogenase (E3), a key component not only of PDC, but also of a-ketoglutarate dehydrogenase, branched-chain a-keto acid dehydrogenase, a-ketoadipate dehydrogenase and the glycine decarboxylase complexes. Two central hypotheses prompted experimental studies. First, it is proposed that VPA may induce inhibition of E3 subunit of PDC that can impact on acetyl-CoA formation and on the flux of metabolites through tricarboxylic acid (TCA) cycle. Second, it is postulated that drug-induced alterations on PDC (or E3) in the nucleus may be related to KDAC activity and with histone acetylation status. In order to investigate these hypotheses, we analyzed organic acids profiles, by GC-MS in urine aliquots of Wistar rats exposed to VPA. In addition, we synthesized the major mitochondrial drug metabolite, valproyl-CoA (VP-CoA), to be tested in vitro as potential inhibitor of E3 activity. To this aim, a spectrophotometric assay was set up and kinetic studies were performed using purified enzyme. Overall results show that VP-CoA clearly inhibits E3 activity in vitro, measured on the reverse direction (rate of NADH oxidation). A similar inhibitory effect of E3 activity was confirmed using liver mitochondrial lysates from rats exposed to VPA (in vivo). Moreover, the urinary levels of intermediates of TCA cycle are shown to be clearly modified with drug administration where an increased excretion of lactic acid associated with VPA was observed. In conclusion, these studies demonstrate that VPA interferes with mitochondrial energy metabolism through multiple mechanisms including a VP-CoA induced inhibition of E3 activity. The impairment of E3-associated complexes and intricate dependence from NAD+/NADH levels may play a pivotal role in pathogenesis of drug-induced liver toxicity.
Descrição
Tese de mestrado, Ciências Biofarmacêuticas, 2021, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia
Palavras-chave
Dihydrolipoamide dehydrogenase Pyruvate dehydrogenase Mitochondrial dysfunction Valproic acid Drug-induced liver toxicity Teses de mestrado -2021