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Hybrid multimodal nanovaccine against colorectal cancer
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Resumo(s)
Cancer is the second most deadly disease in the world, constituting an unmet medical need. One of the most severe types of cancer is the colorectal cancer (CRC), constituting 6% of all cancers and the third leading cause of cancer death worldwide. Incidence and mortality of CRC have increased in the last decades and this is a disease that spreads quickly throughout the body, enabling tumor metastasis by evading its recognition and eradication by host immune system. It is necessary to deeply characterize the mechanisms underlying this complex process in order to rationally develop new alternative approaches able to reverse, or even prevent, its uncontrolled progression and dissemination.
The development of safe and highly immunogenic vaccines to control and eradicate cancer remains one of the most exigent and challenging tasks. Nanoparticle (NP)-based vaccines are promising tools to induce an antigen-specific immune response able to combat tumor development. By prolonging antigen release and extending antigen exposure to antigen presenting cells (APC), nanotechnology based-vaccines will promote the proliferation of tumor-specific cytotoxic T lymphocytes (CTL), thereby increasing anti-tumor efficacy.
α-Galactosylceramide (GalCer) is a glycolipid known as an activator of natural killer T (NKT) cells, following its presentation by dendritic cells (DC) to this sub-population of immune cells. The major goal of this study was to evaluate the synergy between GalCer and major histocompatibility complex (MHC) class I and MHC class II CRC-associated peptide antigens (Adpgk MC38 neoantigen peptides) and the Toll-Like Receptor (TLR) ligands, CpG and Poly (I:C), against CRC development. NP-based vaccine is expected to improve the recognition and processing of peptide-based and lipid-based antigens under evaluation, inducing a broad anti-tumor specific T-cell mediated immunity. This nanovaccine was tested in a CRC murine mouse model, alone or combined with the intratumoral administration of this NP entrapping the TLR ligands associated with GalCer (TME-NP), mimicking the clinical settings currently in development.
The combination of GalCer with CRC peptides and TLR ligands successfully restrained tumor growth when delivered by our nanovaccine. The tumor volume of mice immunized with the nanovaccine or combined with the TME-NP was lower than this presented by mice immunized with the NP entrapping only the TLR ligands associated with GalCer. The association of the nanovaccine with the TME-NP resulted in an improved infiltration of DC, NK and T lymphocytes, including NKT cells and memory T cells. In addition, splenocytes of these animals secreted higher levels of TNF-α, IFN-γ and IL-2. The combined delivery of the NKT cell agonist with CRC antigens and TLR ligands via this multimodal nanovaccine displayed a synergistic anti-tumor immune-mediated efficacy in MC38 CRC mouse model. Even though, it was also identified the infiltration of myeloid-derived suppressor cells (MDSC) and tumor-associated macrophages (TAM). Therefore, the combination of suppressor myeloid-targeted therapies with our multimodal nanovaccine should be considered in order to achieve CRC regression.
Atualmente, o cancro é um dos principais alvos na investigação de novas abordagens terapêuticas, por ser a segunda doença mais mortal do mundo. Um dos tipos de cancro mais severos que existe é o cancro colorectal (CRC), constituindo 6% de todos os cancros e a terceira causa de morte por todo o mundo. A incidência e mortalidade do CRC têm vindo a aumentar nas últimas décadas, sendo uma doença que se alastra de forma rápida e eficaz por todo o corpo, causando as chamadas metástases tumorais, ao impedir o seu reconhecimento e erradicação pelo sistema imunitário do doente. Desta forma, é necessário caracterizar profundamente os mecanismos subjacentes a este processo complexo, a fim de desenvolver novas abordagens alternativas capazes de reverter, ou mesmo prevenir, a sua progressão e disseminação descontroladas. Embora as opções terapêuticas para o tratamento do CRC em estádio avançado ou metastático sejam limitadas e com prognóstico reduzido, os progressos recentes na área da imunoterapia trouxeram melhorias nos resultados terapêuticos. A imunoterapia é um tratamento que visa restaurar ou aumentar a resposta imunitária dos doentes, consistindo em mecanismos imunes específicos, bem como nos seus alvos, apresentando elevada eficácia e especificidade com baixa toxicidade. Modula a resposta imunitária do doente ao antigénio associado ao tumor (TAA), erradica as células tumorais ao reduzir a tolerância do doente ao TAA e fornece proteção de curto e longo prazo contra a doença. Estas terapêuticas inovadoras contra o cancro baseiam-se em respostas anti-tumorais desencadeadas pelo próprio sistema imunitário do doente, através da ativação de uma complexa rede de células imunitárias, tais como, os linfócitos T efetores CD8+, células natural killer (NK) e linfócitos T auxiliares CD4+. No entanto, apesar dos avanços alcançados nas terapêuticas atuais, o desenvolvimento de vacinas seguras e altamente imunogénicas para controlar e erradicar o cancro continua a ser uma das tarefas mais exigentes e desafiantes. As vacinas baseadas em nanopartículas (NP) são ferramentas promissoras para induzir uma resposta imunitária específica para o antigénio, capaz de combater o desenvolvimento do tumor. Ao prolongar a libertação do antigénio e estender a exposição do mesmo a células apresentadoras de antigénio (APC), células altamente especializadas que induzem respostas imunitárias humorais e celulares, as vacinas permitirão a proliferação de linfócitos T citotóxicos (CTL) juntamente com uma resposta do tipo Th1 e de linfócitos T auxiliares juntamente com uma resposta do tipo Th2, aumentando assim a eficácia anti-tumoral. Α α-galactosilceramida (GalCer) é um glicolípido conhecido por ser um ativador das células T natural killer (NKT), após a sua apresentação pelas células dendríticas (DC) a essa subpopulação de células imunitárias. Este estudo teve como objetivo principal avaliar a sinergia entre a GalCer e os antigénios peptídicos associados ao CRC (neoantigénios peptídicos Adpgk MC38) do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) classe I e classe II com os adjuvantes, CpG e Poly (I:C), contra o desenvolvimento do CRC. Deste modo, através de uma vacina baseada em NP, espera-se que a captura de GalCer pelas DC aumente, com subsequente apresentação às células NKT. De igual forma, é esperado que a vacina melhore o reconhecimento e processamento dos antigénios baseados em péptidos e lípidos, induzindo uma imunidade ampla anti-tumoral mediada pelas células T. As NP híbridas foram preparadas utilizando o método de dupla emulsão com evaporação do solvente. Os polímeros poly (lactic-co-glycolic acid) (PLGA), polyethylene glycol (PEG) e mannose, bem como os lípidos 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) e 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phospho-rac-glycerol, sodium salt (DMPG) e o agonista das células NKT (GalCer), foram incluídos na formulação da vacina. O álcool polivinílico (PVA), para aumentar a estabilidade das NP, os antigénios peptídicos associados ao CRC e os adjuvantes Toll-Like Receptor (TLR), CpG e Poly (I:C), para estimularem o sistema imunitário e, deste modo, aumentarem a resposta imunitária dos antigénios, foram igualmente incorporados nas NP. A caracterização das NP foi realizada tendo em conta o tamanho, a carga e morfologia da sua superfície por Dispersão Dinâmica de Luz, Velocimetria por Laser Doppler e Microscopia de Força Atómica, respetivamente. A estabilidade das mesmas foi avaliada em PBS a 4 ˚C, para condições de armazenamento e a 37 ˚C, para simular a temperatura fisiológica. A eficiência de incorporação (EE, % (w/w)) e capacidade de carga (LC, μg/mg) dos antigénios incorporados foram quantificadas por ensaio de fluorescamina e dos adjuvantes incorporados, CpG e Poly (I:C), foram quantificadas por ensaios de Oligreen e Picogreen, respetivamente. As DC foram usadas para avaliar a citotoxicidade in vitro das NP através do ensaio de MTT, seguido de um ensaio com iodeto de propídio (PI), para confirmar os resultados obtidos pelo MTT. A captura e tráfego intracelular das NP marcadas com Cy-5 foram estudados por citometria de fluxo. Posteriormente, um estudo in vivo com ratinhos inoculados com células MC38 foi realizado, com o objetivo de avaliar a eficácia anti-tumoral da nanovacina no crescimento tumoral, onde o peso corporal dos animais e o crescimento dos tumores em conjunto com a condição global de saúde foram monitorizados, três vezes por semana. No final do estudo, os ratinhos foram eutanasiados. Esplenócitos e tumores foram recolhidos para análise por citometria de fluxo, para posterior caracterização das distintas populações de células que infiltram este tumor, nomeadamente, linfócitos T, células NK e células derivadas do compartimento mielóide (MDSC). As NP apresentaram um diâmetro hidrodinâmico médio compreendido entre 138-168 nm, com um índice de polidispersão estreito (PdI <0.2), carga à superfície da NP próxima da neutralidade e forma esférica. As NP apresentaram elevada estabilidade nas condições testadas. Estes sistemas de transporte de antigénios apresentaram elevados EE e LC sendo que, nenhum efeito citotóxico em DC, na gama de concentrações testadas (0.25-1 mg/ml) após 24, 48, 72 e 96 h de incubação foi observado, não tendo sido afetada a viabilidade das DC. A análise por citometria de fluxo confirmou a internalização das NP. Tendo em consideração os resultados previamente descritos, nomeadamente as características físico-químicas das NP, a formulação 50% (w/w) PLGA, 10% (w/w) PLGA-PEG, 20% (w/w) PLGA-mannose e 20% (w/w) POPC/DMPG foi selecionada para prosseguir os estudos in vivo. O principal objetivo do estudo in vivo foi investigar o impacto na imunidade anti-tumoral através de uma administração subcutânea de uma combinação de GalCer com os antigénios associados ao CRC e os ligandos TLR, dispersos dentro da matriz da NP, tendo como alvo as APC, ou através da combinação desta NP com uma administração intratumoral constituída pela GalCer combinada com os ligandos TLR (TME-NP), tendo como alvo células tumorais. A combinação de GalCer com os antigénios associados ao CRC e os ligandos TLR restringiram, de forma eficaz, o crescimento do tumor, quando administrada pela nossa nanovacina. O crescimento do tumor nos grupos de ratinhos imunizados com a nanovacina ou combinada com a TME-NP foi inferior ao crescimento do tumor apresentado por ratinhos imunizados com a NP constituída pela Galcer combinada apenas com os ligandos TLR. Todos os animais aumentaram o peso corporal, o que demonstra a segurança e tolerabilidade das formulações. Por sua vez, os pesos dos tumores apresentados por cada ratinho dentro dos diferentes grupos de tratamento apresentaram menor variabilidade dos que os apresentados pelos ratinhos tratados com PBS, o que demonstra que o tratamento foi eficaz. Com exceção do grupo controlo, todos os animais dos restantes grupos de tratamento apresentaram uma sobrevivência de 100% até ao final do ensaio. A associação da nanovacina com a TME-NP resultou num aumento da infiltração de DC, NK e linfócitos T, incluindo células NKT e células T de memória. Além disso, os esplenócitos destes animais secretaram elevados níveis de fator de necrose tumoral (TNF) -α, interferão (IFN) -γ e interleucina (IL) -2. Para concluir, foi reportado o desenho, a síntese e otimização de um sistema de entrega bem-caracterizado e altamente reprodutível e eficaz, que tem como alvo as DC. Desta forma, foram desenvolvidas NP híbridas seguras, biodegradáveis, estáveis e monodispersas, baseadas na sua composição e propriedades físico-químicas, como nanovacinas contra o cancro e a sua combinação com a GalCer. No geral, a entrega combinada do agonista das células NKT com os antigénios associados ao CRC e com os ligandos TLR por meio desta nanovacina multimodal, exibiu uma eficácia sinergística anti-tumoral no modelo de ratinho com células MC38 de CRC, ao conectar respostas imunitárias inatas e adaptativas. Ainda assim, também foi identificada a infiltração de MDSC e de macrófagos associados ao tumor (TAM), o que pode comprometer a eficácia da imunoterapia. Como tal, a combinação de terapias direcionadas para as mielóides supressoras, com a nossa vacina multimodal, deve ser considerada para alcançar a regressão do CRC.
Atualmente, o cancro é um dos principais alvos na investigação de novas abordagens terapêuticas, por ser a segunda doença mais mortal do mundo. Um dos tipos de cancro mais severos que existe é o cancro colorectal (CRC), constituindo 6% de todos os cancros e a terceira causa de morte por todo o mundo. A incidência e mortalidade do CRC têm vindo a aumentar nas últimas décadas, sendo uma doença que se alastra de forma rápida e eficaz por todo o corpo, causando as chamadas metástases tumorais, ao impedir o seu reconhecimento e erradicação pelo sistema imunitário do doente. Desta forma, é necessário caracterizar profundamente os mecanismos subjacentes a este processo complexo, a fim de desenvolver novas abordagens alternativas capazes de reverter, ou mesmo prevenir, a sua progressão e disseminação descontroladas. Embora as opções terapêuticas para o tratamento do CRC em estádio avançado ou metastático sejam limitadas e com prognóstico reduzido, os progressos recentes na área da imunoterapia trouxeram melhorias nos resultados terapêuticos. A imunoterapia é um tratamento que visa restaurar ou aumentar a resposta imunitária dos doentes, consistindo em mecanismos imunes específicos, bem como nos seus alvos, apresentando elevada eficácia e especificidade com baixa toxicidade. Modula a resposta imunitária do doente ao antigénio associado ao tumor (TAA), erradica as células tumorais ao reduzir a tolerância do doente ao TAA e fornece proteção de curto e longo prazo contra a doença. Estas terapêuticas inovadoras contra o cancro baseiam-se em respostas anti-tumorais desencadeadas pelo próprio sistema imunitário do doente, através da ativação de uma complexa rede de células imunitárias, tais como, os linfócitos T efetores CD8+, células natural killer (NK) e linfócitos T auxiliares CD4+. No entanto, apesar dos avanços alcançados nas terapêuticas atuais, o desenvolvimento de vacinas seguras e altamente imunogénicas para controlar e erradicar o cancro continua a ser uma das tarefas mais exigentes e desafiantes. As vacinas baseadas em nanopartículas (NP) são ferramentas promissoras para induzir uma resposta imunitária específica para o antigénio, capaz de combater o desenvolvimento do tumor. Ao prolongar a libertação do antigénio e estender a exposição do mesmo a células apresentadoras de antigénio (APC), células altamente especializadas que induzem respostas imunitárias humorais e celulares, as vacinas permitirão a proliferação de linfócitos T citotóxicos (CTL) juntamente com uma resposta do tipo Th1 e de linfócitos T auxiliares juntamente com uma resposta do tipo Th2, aumentando assim a eficácia anti-tumoral. Α α-galactosilceramida (GalCer) é um glicolípido conhecido por ser um ativador das células T natural killer (NKT), após a sua apresentação pelas células dendríticas (DC) a essa subpopulação de células imunitárias. Este estudo teve como objetivo principal avaliar a sinergia entre a GalCer e os antigénios peptídicos associados ao CRC (neoantigénios peptídicos Adpgk MC38) do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) classe I e classe II com os adjuvantes, CpG e Poly (I:C), contra o desenvolvimento do CRC. Deste modo, através de uma vacina baseada em NP, espera-se que a captura de GalCer pelas DC aumente, com subsequente apresentação às células NKT. De igual forma, é esperado que a vacina melhore o reconhecimento e processamento dos antigénios baseados em péptidos e lípidos, induzindo uma imunidade ampla anti-tumoral mediada pelas células T. As NP híbridas foram preparadas utilizando o método de dupla emulsão com evaporação do solvente. Os polímeros poly (lactic-co-glycolic acid) (PLGA), polyethylene glycol (PEG) e mannose, bem como os lípidos 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) e 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phospho-rac-glycerol, sodium salt (DMPG) e o agonista das células NKT (GalCer), foram incluídos na formulação da vacina. O álcool polivinílico (PVA), para aumentar a estabilidade das NP, os antigénios peptídicos associados ao CRC e os adjuvantes Toll-Like Receptor (TLR), CpG e Poly (I:C), para estimularem o sistema imunitário e, deste modo, aumentarem a resposta imunitária dos antigénios, foram igualmente incorporados nas NP. A caracterização das NP foi realizada tendo em conta o tamanho, a carga e morfologia da sua superfície por Dispersão Dinâmica de Luz, Velocimetria por Laser Doppler e Microscopia de Força Atómica, respetivamente. A estabilidade das mesmas foi avaliada em PBS a 4 ˚C, para condições de armazenamento e a 37 ˚C, para simular a temperatura fisiológica. A eficiência de incorporação (EE, % (w/w)) e capacidade de carga (LC, μg/mg) dos antigénios incorporados foram quantificadas por ensaio de fluorescamina e dos adjuvantes incorporados, CpG e Poly (I:C), foram quantificadas por ensaios de Oligreen e Picogreen, respetivamente. As DC foram usadas para avaliar a citotoxicidade in vitro das NP através do ensaio de MTT, seguido de um ensaio com iodeto de propídio (PI), para confirmar os resultados obtidos pelo MTT. A captura e tráfego intracelular das NP marcadas com Cy-5 foram estudados por citometria de fluxo. Posteriormente, um estudo in vivo com ratinhos inoculados com células MC38 foi realizado, com o objetivo de avaliar a eficácia anti-tumoral da nanovacina no crescimento tumoral, onde o peso corporal dos animais e o crescimento dos tumores em conjunto com a condição global de saúde foram monitorizados, três vezes por semana. No final do estudo, os ratinhos foram eutanasiados. Esplenócitos e tumores foram recolhidos para análise por citometria de fluxo, para posterior caracterização das distintas populações de células que infiltram este tumor, nomeadamente, linfócitos T, células NK e células derivadas do compartimento mielóide (MDSC). As NP apresentaram um diâmetro hidrodinâmico médio compreendido entre 138-168 nm, com um índice de polidispersão estreito (PdI <0.2), carga à superfície da NP próxima da neutralidade e forma esférica. As NP apresentaram elevada estabilidade nas condições testadas. Estes sistemas de transporte de antigénios apresentaram elevados EE e LC sendo que, nenhum efeito citotóxico em DC, na gama de concentrações testadas (0.25-1 mg/ml) após 24, 48, 72 e 96 h de incubação foi observado, não tendo sido afetada a viabilidade das DC. A análise por citometria de fluxo confirmou a internalização das NP. Tendo em consideração os resultados previamente descritos, nomeadamente as características físico-químicas das NP, a formulação 50% (w/w) PLGA, 10% (w/w) PLGA-PEG, 20% (w/w) PLGA-mannose e 20% (w/w) POPC/DMPG foi selecionada para prosseguir os estudos in vivo. O principal objetivo do estudo in vivo foi investigar o impacto na imunidade anti-tumoral através de uma administração subcutânea de uma combinação de GalCer com os antigénios associados ao CRC e os ligandos TLR, dispersos dentro da matriz da NP, tendo como alvo as APC, ou através da combinação desta NP com uma administração intratumoral constituída pela GalCer combinada com os ligandos TLR (TME-NP), tendo como alvo células tumorais. A combinação de GalCer com os antigénios associados ao CRC e os ligandos TLR restringiram, de forma eficaz, o crescimento do tumor, quando administrada pela nossa nanovacina. O crescimento do tumor nos grupos de ratinhos imunizados com a nanovacina ou combinada com a TME-NP foi inferior ao crescimento do tumor apresentado por ratinhos imunizados com a NP constituída pela Galcer combinada apenas com os ligandos TLR. Todos os animais aumentaram o peso corporal, o que demonstra a segurança e tolerabilidade das formulações. Por sua vez, os pesos dos tumores apresentados por cada ratinho dentro dos diferentes grupos de tratamento apresentaram menor variabilidade dos que os apresentados pelos ratinhos tratados com PBS, o que demonstra que o tratamento foi eficaz. Com exceção do grupo controlo, todos os animais dos restantes grupos de tratamento apresentaram uma sobrevivência de 100% até ao final do ensaio. A associação da nanovacina com a TME-NP resultou num aumento da infiltração de DC, NK e linfócitos T, incluindo células NKT e células T de memória. Além disso, os esplenócitos destes animais secretaram elevados níveis de fator de necrose tumoral (TNF) -α, interferão (IFN) -γ e interleucina (IL) -2. Para concluir, foi reportado o desenho, a síntese e otimização de um sistema de entrega bem-caracterizado e altamente reprodutível e eficaz, que tem como alvo as DC. Desta forma, foram desenvolvidas NP híbridas seguras, biodegradáveis, estáveis e monodispersas, baseadas na sua composição e propriedades físico-químicas, como nanovacinas contra o cancro e a sua combinação com a GalCer. No geral, a entrega combinada do agonista das células NKT com os antigénios associados ao CRC e com os ligandos TLR por meio desta nanovacina multimodal, exibiu uma eficácia sinergística anti-tumoral no modelo de ratinho com células MC38 de CRC, ao conectar respostas imunitárias inatas e adaptativas. Ainda assim, também foi identificada a infiltração de MDSC e de macrófagos associados ao tumor (TAM), o que pode comprometer a eficácia da imunoterapia. Como tal, a combinação de terapias direcionadas para as mielóides supressoras, com a nossa vacina multimodal, deve ser considerada para alcançar a regressão do CRC.
Descrição
Tese de mestrado, Ciências Biofarmacêuticas, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2019
Palavras-chave
Colorectal cancer Nanovaccines α-Galactosylceramide Natural killer T cells Antigen presenting cells Teses de mestrado - 2019