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In vitro combined toxicity of hexavalent chromium, nickel and benzo(a)pyrene in human lung cells
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Resumo(s)
Risk assessment of chemicals mainly relies on exposure to single chemicals and their hazardous effects, although the real scenario in occupational settings is more commonly characterized by exposure to chemical mixtures. Chromium (Cr), Nickel (Ni), and Polycyclic Aromatic Hydrocarbons (PAHs) are often present in occupational settings, such as aeronautic industries, where workers are exposed primarily through inhalation. Considering that those substances are recognized lung carcinogens acting mainly by genotoxic mechanisms, it is likely that interactive effects occur, indicating that the risk from occupational exposure to these chemicals should be assessed as a mixture. Such issue is being addressed in the HBM4EU Initiative, where a real scenario of occupational exposure has been studied. In order to provide support to the hazard assessment of the referred mixture, the present work aimed to evaluate the combined toxicity of Cr(VI), Ni, and benzo(a)pyrene (BaP), using a human lung cell line (A549 cells). Cytotoxicity was assessed after 24 and 48h of exposure to different concentrations of each compound and mixture of compounds. MTT assay was performed for the different mixtures and for each individual chemical and a dose-response curve was established, enabling the determination of the IC50, when possible. Genotoxicity was assessed through the micronucleus assay, after exposure for 24h, for single and mixture of compounds. The combined genotoxicity and cytotoxicity of the Cr and Ni mixture as well as that of Cr, Ni and BaP were determined comparatively to the single chemicals’ toxicity to ascertain whether additive effects or deviations from additivity towards synergism or antagonism was obtained. The results showed a high level of cytotoxicity for single Cr(VI) and single nickel; on the other hand, single BaP exposure didn’t show a significant decrease in A549 viability. Genotoxicity results for the three compounds, all showed an increase in micronuclei frequency for all tested concentrations, confirming their genotoxic potential. Binary mixtures with Cr(VI) and nickel all caused a significant decrease in cell viability for both 24 and 48h of exposure, and modelling results with the CA model showed a weak antagonism whereas with the IA model, a synergistic effect was found for lower concentrations, with an alteration to antagonism at higher concentrations. Ternary mixture with Cr(VI), nickel and BaP also caused a significant decrease in cell viability, and although no modelling was performed, an apparent antagonistic effect was observed. At a genotoxic level, both binary and ternary mixtures caused a significant increase in micronuclei frequency, and modelling results for the binary mixture showed, with the CA model, an additivity effect and with the IA model, a synergistic effect. Once again for the ternary mixture, although no modelling was performed, an apparent antagonistic effect was found. In order to consolidate the information and results presented in this work, it is necessary to explore more concentrations and different combinations. In addition, other relevant endpoints should also be explored, for example, epigenetic effects, ROS generation and effects on DNA repair.
A avaliação de risco de diversos químicos baseia-se maioritariamente na exposição aos mesmos individualmente e aos seus efeitos adversos, apesar do cenário real, em âmbito ocupacional, ser caracterizado mais frequentemente pela exposição a misturas de substâncias. Dos efeitos que podem resultar dos diferentes tipos de exposição a misturas de substâncias, existem dois de extrema importância, o cancro e alterações genéticas que podem aparecer, não só na população exposta, mas também nos possíveis descendentes dessa mesma população. Tanto o Crómio, como o Níquel e os Hidrocarbonetos Aromáticos Policíclicos estão frequentemente presentes em âmbito ocupacional, como por exemplo na indústria aeronáutica, onde os trabalhadores estão expostos a estes químicos, principalmente através da inalação. Uma vez que essas substâncias são reconhecidas como carcinogénicas pulmonares, atuando através de mecanismos genotóxicos, é provável que ocorra um efeito interativo, indicando que o risco de exposição ocupacional a estes químicos devia de ser avaliado como uma mistura. No entanto, esta avaliação e interpretação é extremamente complexa e requer a intervenção de várias áreas distintas, tornando assim o estudo da exposição a misturas um trabalho demorado e com várias variáveis a ter em consideração. Esta problemática tem sido estudada na iniciativa do HBM4EU, onde um cenário verídico de exposição ocupacional tem sido estudado. Este é um projeto europeu de biomonitorização humana, que tem como principal objetivo avaliar a exposição humana, principalmente a nível ocupacional, a diversos químicos e os principais efeitos na saúde humana. Com este esforço, o projeto pretende criar uma ligação com as entidades legislativas, de modo a garantir que os dados obtidos possam ser utilizados para a criação de leis e medidas que minimizem a exposição aos compostos de risco. Dado que a exposição ocupacional se torna contínua e possivelmente com valores mais elevados de concentrações das várias substâncias do que a exposição ambiental da população em geral, é de extrema importância identificar os vários poluentes ocupacionais de interesse e intervir de modo a reduzir a sua emissão e promover a proteção pessoal da população exposta diariamente a substâncias de risco, no âmbito da sua profissão. De forma a promover informação sobre a avaliação de risco da mistura referida, este trabalho tem como objetivo avaliar a toxicidade individual e conjunta do Crómio (VI), Níquel e Benzo(a)pireno, utilizando uma linha celular pulmonar humana (células A549), criando um modelo in vitro para a exposição ocupacional. Esta linha celular foi selecionada, uma vez que a exposição ocupacional a estas três substâncias ocorre principalmente por via inalatória. Numa fase inicial de trabalho, antes de serem realizados ensaios de genotoxicidade, é importante selecionar primeiro um intervalo de concentrações de cada substância, baseado na sua toxicidade. Os ensaios de citotoxicidade são usados precisamente para este fim e determinam os efeitos na viabilidade e proliferação celular. O ensaio de citotoxicidade utilizado foi o ensaio do MTT [brometo de 3-(4,5-dimetiliazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio] que foi realizado para cada químico individualmente, com um período de exposição de 24 e 48h, e foi determinada uma curva dose-efeito, permitindo a determinação do IC50. A citotoxicidade (medida durante um período de exposição de 24 e 48h) e genotoxicidade (num período de exposição de 48h), medida através do ensaio do micronúcleo, da mistura binária de Crómio e de Níquel, assim como da ternária com Crómio, Níquel e Benzo(a)pireno foram também determinadas comparativamente à citotoxicidade e genotoxicidade individual de cada químico para perceber se foram obtidos efeitos aditivos ou desvios da aditividade para o sinergismo ou antagonismo. Os resultados obtidos demonstraram níveis elevados de citotoxicidade para o Cr(VI) e o níquel, avaliados separadamente, com valores de IC50 de 3,30 µM e 1,28 µM para o Cr(VI), para os tempos de exposição de 24 e 48h, respetivamente. Para o níquel foram obtidos valores de IC50 de 0,51 mM e 0,22 mM, para os tempos de exposição de 24 e 48h, respetivamente. Para ambos os metais observou-se uma relação dose efeito. Por outro lado, a exposição ao BaP não provocou um decréscimo significativo da viabilidade celular das células A549, ao contrário do que se esperava através da revisão da literatura, não demonstrando ser, a partir destes dados, uma substância citotóxica. Os resultados da genotoxicidade para as três substâncias individuais, mostraram um aumento significativo da frequência de micronúcleos para todas as concentrações testadas, confirmando o seu potencial genotóxico promovido, principalmente, pela formação de espécies reativas de oxigénio (ROS) em processos de destoxificação, causando níveis elevados de stress oxidativo nas células. Para além disso, os ROS têm também a capacidade de interagir diretamente com o DNA e provocar quebras e lesões no mesmo, detetadas através dos ensaios de genotoxicidade. Todas misturas binárias, realizadas, de Cr(VI) e níquel causaram decréscimos significativos da viabilidade celular após 24 e 48h de exposição. Para além da análise direta dos dados obtidos para as misturas, foi também realizada a modelação matemática dos mesmos dados para a obtenção de informação relativa ao modo de interação das substâncias. Para isso foram aplicados dois modelos distintos, o “Concentration addition” (CA) e o “Independent Action” (IA). Ambos os modelos baseiamse no modo de ação de cada substância. Se considerarmos que as substâncias têm modos de ação semelhantes, então o modelo a aplicar seria o CA, por outro lado se tiverem modos de ação diferentes, o modelo mais adequado é o IA. Dado que os processos pelos quais tanto o Cr(VI) como o níquel e o BaP causam toxicidade são muito complexos, diversificados e ainda alvo de grande estudo, seria reducionista limitarmo-nos apenas a um modelo matemático para explicar a interação das misturas. Sendo assim, optámos por utilizar os dois modelos mais reconhecidos atualmente e comparar a informação obtida através de cada um. No caso da mistura binária de Cr(VI) e níquel, os resultados da modelação matemática, para 24 e 48h, com o modelo CA indicaram um efeito fraco de antagonismo, por outro lado, com o modelo IA foi obtido um efeito sinergístico em concentrações baixas, alterando para um efeito antagonista nas concentrações acima do IC50 da mistura. No caso da mistura ternária de Cr(VI), níquel e BaP, houve também um decréscimo significativo da viabilidade celular após 24 e 48h de exposição. Neste caso, como apenas foi testada uma mistura, não houve dados suficientes para a realização de uma modelação matemática adequada, no entanto, a partir dos resultados obtidos podemos inferir empiricamente que a toxicidade das três substâncias foi inferior ao esperado da soma das suas toxicidades, mostrando então um efeito antagonista da mistura. Ao nível genotóxico, as misturas binárias causaram aumentos significativos na frequência de micronúcleos e os resultados da modelação através do modelo CA mostraram um efeito aditivo, e com o modelo IA, foi obtido um efeito sinergístico. Com a mistura ternária, novamente existiram aumentos significativos na frequência de micronúcleos e devido à falta de dados para uma modelação matemática adequada, já mencionado anteriormente, apenas foi possível fazer uma avaliação empírica dos efeitos da mistura. Considerando que cada químico, por si, tem a capacidade de induzir micronúcleos, se os seus efeitos fossem aditivos seria de esperar uma frequência de micronúcleos muito elevada na mistura, o que não foi o caso. Sendo assim, e tendo por base esta observação podemos inferir que estamos perante um desvio para o efeito antagonista da mistura de Cr(VI), níquel e BaP. De modo a consolidar a informação obtida neste trabalho, um maior número de concentrações e, por consequência, um maior número de combinações deverá ser explorado futuramente, em próximos trabalhos relativos ao tema, de modo a aumentar o poder da modelação matemática e poder corroborar ou retificar os resultados obtidos nesta dissertação.
A avaliação de risco de diversos químicos baseia-se maioritariamente na exposição aos mesmos individualmente e aos seus efeitos adversos, apesar do cenário real, em âmbito ocupacional, ser caracterizado mais frequentemente pela exposição a misturas de substâncias. Dos efeitos que podem resultar dos diferentes tipos de exposição a misturas de substâncias, existem dois de extrema importância, o cancro e alterações genéticas que podem aparecer, não só na população exposta, mas também nos possíveis descendentes dessa mesma população. Tanto o Crómio, como o Níquel e os Hidrocarbonetos Aromáticos Policíclicos estão frequentemente presentes em âmbito ocupacional, como por exemplo na indústria aeronáutica, onde os trabalhadores estão expostos a estes químicos, principalmente através da inalação. Uma vez que essas substâncias são reconhecidas como carcinogénicas pulmonares, atuando através de mecanismos genotóxicos, é provável que ocorra um efeito interativo, indicando que o risco de exposição ocupacional a estes químicos devia de ser avaliado como uma mistura. No entanto, esta avaliação e interpretação é extremamente complexa e requer a intervenção de várias áreas distintas, tornando assim o estudo da exposição a misturas um trabalho demorado e com várias variáveis a ter em consideração. Esta problemática tem sido estudada na iniciativa do HBM4EU, onde um cenário verídico de exposição ocupacional tem sido estudado. Este é um projeto europeu de biomonitorização humana, que tem como principal objetivo avaliar a exposição humana, principalmente a nível ocupacional, a diversos químicos e os principais efeitos na saúde humana. Com este esforço, o projeto pretende criar uma ligação com as entidades legislativas, de modo a garantir que os dados obtidos possam ser utilizados para a criação de leis e medidas que minimizem a exposição aos compostos de risco. Dado que a exposição ocupacional se torna contínua e possivelmente com valores mais elevados de concentrações das várias substâncias do que a exposição ambiental da população em geral, é de extrema importância identificar os vários poluentes ocupacionais de interesse e intervir de modo a reduzir a sua emissão e promover a proteção pessoal da população exposta diariamente a substâncias de risco, no âmbito da sua profissão. De forma a promover informação sobre a avaliação de risco da mistura referida, este trabalho tem como objetivo avaliar a toxicidade individual e conjunta do Crómio (VI), Níquel e Benzo(a)pireno, utilizando uma linha celular pulmonar humana (células A549), criando um modelo in vitro para a exposição ocupacional. Esta linha celular foi selecionada, uma vez que a exposição ocupacional a estas três substâncias ocorre principalmente por via inalatória. Numa fase inicial de trabalho, antes de serem realizados ensaios de genotoxicidade, é importante selecionar primeiro um intervalo de concentrações de cada substância, baseado na sua toxicidade. Os ensaios de citotoxicidade são usados precisamente para este fim e determinam os efeitos na viabilidade e proliferação celular. O ensaio de citotoxicidade utilizado foi o ensaio do MTT [brometo de 3-(4,5-dimetiliazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio] que foi realizado para cada químico individualmente, com um período de exposição de 24 e 48h, e foi determinada uma curva dose-efeito, permitindo a determinação do IC50. A citotoxicidade (medida durante um período de exposição de 24 e 48h) e genotoxicidade (num período de exposição de 48h), medida através do ensaio do micronúcleo, da mistura binária de Crómio e de Níquel, assim como da ternária com Crómio, Níquel e Benzo(a)pireno foram também determinadas comparativamente à citotoxicidade e genotoxicidade individual de cada químico para perceber se foram obtidos efeitos aditivos ou desvios da aditividade para o sinergismo ou antagonismo. Os resultados obtidos demonstraram níveis elevados de citotoxicidade para o Cr(VI) e o níquel, avaliados separadamente, com valores de IC50 de 3,30 µM e 1,28 µM para o Cr(VI), para os tempos de exposição de 24 e 48h, respetivamente. Para o níquel foram obtidos valores de IC50 de 0,51 mM e 0,22 mM, para os tempos de exposição de 24 e 48h, respetivamente. Para ambos os metais observou-se uma relação dose efeito. Por outro lado, a exposição ao BaP não provocou um decréscimo significativo da viabilidade celular das células A549, ao contrário do que se esperava através da revisão da literatura, não demonstrando ser, a partir destes dados, uma substância citotóxica. Os resultados da genotoxicidade para as três substâncias individuais, mostraram um aumento significativo da frequência de micronúcleos para todas as concentrações testadas, confirmando o seu potencial genotóxico promovido, principalmente, pela formação de espécies reativas de oxigénio (ROS) em processos de destoxificação, causando níveis elevados de stress oxidativo nas células. Para além disso, os ROS têm também a capacidade de interagir diretamente com o DNA e provocar quebras e lesões no mesmo, detetadas através dos ensaios de genotoxicidade. Todas misturas binárias, realizadas, de Cr(VI) e níquel causaram decréscimos significativos da viabilidade celular após 24 e 48h de exposição. Para além da análise direta dos dados obtidos para as misturas, foi também realizada a modelação matemática dos mesmos dados para a obtenção de informação relativa ao modo de interação das substâncias. Para isso foram aplicados dois modelos distintos, o “Concentration addition” (CA) e o “Independent Action” (IA). Ambos os modelos baseiamse no modo de ação de cada substância. Se considerarmos que as substâncias têm modos de ação semelhantes, então o modelo a aplicar seria o CA, por outro lado se tiverem modos de ação diferentes, o modelo mais adequado é o IA. Dado que os processos pelos quais tanto o Cr(VI) como o níquel e o BaP causam toxicidade são muito complexos, diversificados e ainda alvo de grande estudo, seria reducionista limitarmo-nos apenas a um modelo matemático para explicar a interação das misturas. Sendo assim, optámos por utilizar os dois modelos mais reconhecidos atualmente e comparar a informação obtida através de cada um. No caso da mistura binária de Cr(VI) e níquel, os resultados da modelação matemática, para 24 e 48h, com o modelo CA indicaram um efeito fraco de antagonismo, por outro lado, com o modelo IA foi obtido um efeito sinergístico em concentrações baixas, alterando para um efeito antagonista nas concentrações acima do IC50 da mistura. No caso da mistura ternária de Cr(VI), níquel e BaP, houve também um decréscimo significativo da viabilidade celular após 24 e 48h de exposição. Neste caso, como apenas foi testada uma mistura, não houve dados suficientes para a realização de uma modelação matemática adequada, no entanto, a partir dos resultados obtidos podemos inferir empiricamente que a toxicidade das três substâncias foi inferior ao esperado da soma das suas toxicidades, mostrando então um efeito antagonista da mistura. Ao nível genotóxico, as misturas binárias causaram aumentos significativos na frequência de micronúcleos e os resultados da modelação através do modelo CA mostraram um efeito aditivo, e com o modelo IA, foi obtido um efeito sinergístico. Com a mistura ternária, novamente existiram aumentos significativos na frequência de micronúcleos e devido à falta de dados para uma modelação matemática adequada, já mencionado anteriormente, apenas foi possível fazer uma avaliação empírica dos efeitos da mistura. Considerando que cada químico, por si, tem a capacidade de induzir micronúcleos, se os seus efeitos fossem aditivos seria de esperar uma frequência de micronúcleos muito elevada na mistura, o que não foi o caso. Sendo assim, e tendo por base esta observação podemos inferir que estamos perante um desvio para o efeito antagonista da mistura de Cr(VI), níquel e BaP. De modo a consolidar a informação obtida neste trabalho, um maior número de concentrações e, por consequência, um maior número de combinações deverá ser explorado futuramente, em próximos trabalhos relativos ao tema, de modo a aumentar o poder da modelação matemática e poder corroborar ou retificar os resultados obtidos nesta dissertação.
Descrição
Tese de Mestrado, Biologia Humana e Ambiente, 2021, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências
Palavras-chave
Misturas Avaliação de risco Saúde ocupacional Crómio hexavalente Níquel e HAPs Teses de mestrado - 2021