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Publicação
Neuronal dynamics underlying stimulus selection for zebrafish orienting behaviour
| Nome: | Descrição: | Tamanho: | Formato: | |
|---|---|---|---|---|
| 14.83 MB | Adobe PDF |
Autores
Orientador(es)
Resumo(s)
Compreender os processos neuronais que recebem dados sensoriais, definem decisões e realizam
ações relevantes é crucial para desvendar os mistérios da neurociência. Para aprofundar o conhecimento
sobre este tema, o peixe-zebra tem sido um dos organismos modelos mais utilizados para pesquisas
fundamentais, devido a uma panóplia de fatores como o seu repertório comportamental diversificado,
criação facilitada, tamanho diminuto e transparência óptica.
Neste estudo, investigámos os mecanismos neurais subjacentes à seleção de estímulos sensoriais
nos peixes-zebra (Danio rerio), focando nos processos envolvidos nas várias respostas de orientação
a estímulos ambientais através da integração de dois estímulos visuais documentados na literatura —
movimento global (resposta optomotora) e colisão local com objeto (movimento de perseguição). Para
atingir este fim, foram efetuadas experiências comportamentais colocando larvas de peixe-zebra de 6-7
dias de vida em arenas quadradas de cantos arredondados de 5x5 cm, projetando estímulos visuais na
parte inferior à arena e gravando com uma câmera de infravermelhos. Adicionalmente, foram capturadas
imagens cerebrais de peixes-zebra geneticamente modificados com proteínas fluorescentes através de um
microscópio de 2 fotões para compreender se e como os neurónios são afetados em situações em que o
peixe é perturbado visualmente por mais que um estímulo.
Para obter esta combinação de perturbações visuais, o desenvolvimento de um estímulo de movimento global compatível com a sobreposição de um ponto em perseguição é fundamental. Devido a
isto, um padrão personalizável constituído por um conjunto aleatório de pontos do mesmo tamanho e
duração foi criado. Este deveria ser capaz de produzir fluxo óptico semelhante ao estímulo tradicional
de resposta optomora - as grades bicolores. Com este intuito, o padrão foi validado para quatro direções,
estabelecendo os parâmetros que resultam na resposta mais análoga às grades. Dos fatores testados, a
quantidade de pontos mostrados sincronamente influenciou significantemente os resultados, pelo que o
tamanho destes pontos não teve o mesmo efeito. Deste modo, os parâmetros escolhidos para otimizar a
resposta foram 1000 e 2000 pontos por 6x6 cm com diâmetro de 1 e 2 mm cada.
Posteriormente, um ponto com o objetivo de perseguir o peixe foi integrado ao padrão de pontos
criado. Este representa um objeto em colisão ou predador em caça, revelando-se 8 segundos após o
começo do movimento dos pontos do padrão a 2.5 cm diretamente à esquerda ou direita do corpo do
peixe aproximando-se a uma velocidade de 1 cm/s com 2 possíveis diâmetros de 3.5 e 4 mm. A análise
dos dados obtidos na experiência demonstraram uma supressão total do estímulo de perseguição pela
falta de movimentos de fuga. Em função destes resultados, foram formalizadas hipóteses de que o peixe
não foi capaz de detectar o movimento do ponto de perseguição devido ao conflito visual com o padrão
de pontos, ficou habituado ao estímulo de colisão ou foi estimulado em demasia pela resposta optomora.
Para poder compreender melhor esta omissão de respostas ao estímulo de perseguição, foram feitos
múltiplos testes a diversos parâmetros de ambos os estímulos. Para o estímulo de evasão, tanto o tamanho
do ponto de perseguição como o tempo entre segmentos de aproximação foram aumentados. Este intervalo de tempo acrescido melhorou as respostas, no entanto, verificou-se que existia uma relação inversa
entre o aumento do tamanho do ponto de perseguição e a resposta correspondente. Foi deduzido que o
diâmetro mais adequado deste objeto seria 3.5 mm. Nos testes relativos ao padrão de pontos, o tempo
de vida, contraste dos pontos do padrão com o ponto de perseguição e luminância do fundo foram as
variantes em que nos focámos. Após análise dos testes, foi determinado que o parâmetro que mais influencia a probabilidade de resposta ao ponto de perseguição foi o contraste de luminância entre estímulos.
Os intervalos de luminância dos pontos do padrão foram caracterizados com base na resposta ao estímulo de perseguição, sendo as probabilidades de fuga significantes verificadas quando os pontos tinham
uma luminância entre 50 a 100%. Após estabelecer as condições nas quais a resposta ao movimento
de perseguição não é totalmente suprimida pelo padrão de pontos estáticos, foi necessário avaliar como
é que o contraste reduzido do padrão de pontos aleatórios em movimento afeta a resposta optomotora.
Utilizando 10 intervalos de luminância, uma análise detalhada do comportamento do peixe durante o
movimento global foi avaliada. Como esperado, a resposta optomotora enfraquece à medida que os
níveis de luminância aumentavam, porém, este declínio na sensibilidade comportamental foi mais significativo após o valor de 60% luminância. Através da captura de atividade neuronal do tecido cerebral
associado com resposta optomotora, foi atingido o mesmo intervalo de luminância significativa encontrado na experiência comportamental. Portanto, para não comprometer a intensidade de nenhum dos
dois estímulos ao integrá-los, o valor de luminância selecionado para o padrão de pontos foi de 60% para
repetir o teste com ambos os estímulos incluindo movimento global.
Nesta experiência final, conjugou-se o padrão de pontos aleatórios em movimento com as condições
de luminância previamente aperfeiçoadas e o movimento de perseguição com um maior período de interrupção entre estímulos para evitar habituação e simular um ambiente mais natural. Adicionalmente, um
estímulo de perseguição à frente ao peixe foi adicionado para testar se a trajetória de fuga seria influenciada pelo movimento global de pontos. Os resultados indicaram uma alta taxa de resposta aos estímulos
do ponto de perseguição, de 83%, e uma taxa esperada de resposta optomotora de 37%, sendo que os
peixes que responderam a ambos estímulos perfizeram 31% da população total. Posteriormente à análise,
foi possível concluir que a probabilidade de fuga do ponto de perseguição foi semelhante entre condições
com e sem movimento dos pontos do padrão. Apesar da probabilidade não ser alterada, o mesmo não
pode ser dito da lateralidade e trajetória dos movimentos de fuga de perseguição lateral. Enquanto que
os movimentos de fuga classificados com elevada latência não sofreram alterações, os movimentos com
curto tempo de reação foram substancialmente influenciados pela direção do movimento global. Foi possível concluir que o movimento global afeta a direção da natação do peixe durante a resposta ao ponto de
aproximação, mas também o conjunto de movimentos sucessivos a este episódio, induzindo um estado
de alerta que afeta a resposta optomotora num curto período de tempo.
De forma a complementar este estudo, a atividade cerebral dos peixes foi medida quando apresentados com esta combinação de estímulos e com a adição de condições comparando a supressão da resposta
ao movimento de perseguição em função da luminância. Foi possível observar que a resposta a cada
um dos estímulos era definida em tecidos cerebrais diferentes, com um número reduzido destes demonstrando integração de ambos os estímulos. Adicionalmente, a maioria dos corpos celulares dos neurónios
que ativaram com o movimento de perseguição apresentaram uma maior resposta na condição de maior
luminância, como foi denotado nas experiências comportamentais.
No geral, este estudo alcançou com sucesso os objetivos de implementar e otimizar a combinação
de um padrão de pontos de movimento global com um estímulo de perseguição para investigar como
os peixes-zebra integram e priorizam estímulos visuais. Os efeitos do contraste dos estímulos, direção e
contexto foram estudados com base nas alterações do comportamento do peixe e na medição de atividade
neuronal em tecidos que medeiam a seleção de estímulos. Estes estudos são fulcrais para acrescentar
conhecimento no mundo de pesquisa fundamental, abrindo a porta a futuras investigações de plasticidade
comportamental e caracterização dos circuitos neurais envolvidos em comportamentos defensivos de forma a poder-se estabelecer resultados aplicáveis à saúde humana.
Understanding the neural processes that integrate sensory information, make decisions, and compute relevant actions is fundamental for unravelling the mysteries of neuroscience. Zebrafish (Danio rerio) has been one of the staple model organisms for fundamental research due to many factors ranging from its optical transparency, genetics to a diverse behavioural repertoire. This study aims to decipher the complexities of zebrafish-orienting behaviour in ambiguous environments. Utilizing two previously described behaviours - optomotor swimming in response to global motion and escape response to approaching objects - we developed real-world scenarios in which global and object motion were integrated. A random dot pattern was developed and parameters were optimized to effectively evoke the perception of optic flow. Behavioural testing demonstrated an optomotor response to this pattern which was comparable to a traditional grating pattern and significantly modulated by the density of dots. Integration of the random dot pattern with an approaching object fully suppressed a classical escape response from the object. Detailed testing proved the stimulus contrast as a major modulator of stimulus salience and behavioural responses. Luminance levels optimized for an effective optomotor response and minimal suppression were identified and studied in behavioural and brain imaging experiments. We found that global motion strongly modulated the escape response trajectories and directionality. In addition, orienting swims were significantly biased right after object collision. Neuronal dynamics were identified in the optic tectum that might drive such directed escapes. In summary, various behavioural assays were performed to characterize how zebrafish respond to multiple newly created sensory stimuli and to explore how different features affect the salience of stimuli. Concurrently, calcium imaging studies using 2-photon microscopy shed light on the neural substrates mediating stimulus selection, emphasizing the role of tectal activity for zebrafish orientation behaviour.
Understanding the neural processes that integrate sensory information, make decisions, and compute relevant actions is fundamental for unravelling the mysteries of neuroscience. Zebrafish (Danio rerio) has been one of the staple model organisms for fundamental research due to many factors ranging from its optical transparency, genetics to a diverse behavioural repertoire. This study aims to decipher the complexities of zebrafish-orienting behaviour in ambiguous environments. Utilizing two previously described behaviours - optomotor swimming in response to global motion and escape response to approaching objects - we developed real-world scenarios in which global and object motion were integrated. A random dot pattern was developed and parameters were optimized to effectively evoke the perception of optic flow. Behavioural testing demonstrated an optomotor response to this pattern which was comparable to a traditional grating pattern and significantly modulated by the density of dots. Integration of the random dot pattern with an approaching object fully suppressed a classical escape response from the object. Detailed testing proved the stimulus contrast as a major modulator of stimulus salience and behavioural responses. Luminance levels optimized for an effective optomotor response and minimal suppression were identified and studied in behavioural and brain imaging experiments. We found that global motion strongly modulated the escape response trajectories and directionality. In addition, orienting swims were significantly biased right after object collision. Neuronal dynamics were identified in the optic tectum that might drive such directed escapes. In summary, various behavioural assays were performed to characterize how zebrafish respond to multiple newly created sensory stimuli and to explore how different features affect the salience of stimuli. Concurrently, calcium imaging studies using 2-photon microscopy shed light on the neural substrates mediating stimulus selection, emphasizing the role of tectal activity for zebrafish orientation behaviour.
Descrição
Tese de Mestrado, Engenharia Biomédica e Biofísica, 2024, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências
Palavras-chave
Peixes-zebra Neurobiologia Circuitos Neuronais Comportamento Resposta Optomotora Teses de mestrado - 2024