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Publicação
Structural and functional characterization of the bacterial ferrous homeostasis protein FeoA
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Orientador(es)
Resumo(s)
O objectivo deste trabalho intitulado ““Structural and functional characterization of the bacterial ferrous homeostasis protein FeoA” consistiu na determinação da estrutura e função da proteína FeoA da bacteria E.coli.
A principal via bacteriana de entrada do ferro ferroso é através do sistema Feo que deriva das palavras inglesas ferrous iron transport.
O ferro é um elemento essencial para a maioria dos organismos participando em vias metabólicas essenciais. Os sistemas de importação de ferro seja ele ferro ferroso(Fe2+) ou ferro férrico (Fe3+ ) são importantes alvos terapêuticos limitando o crescimento celular e são por essas razões alvo de estudos científicos.
O sistema Feo é o principal responsável pela importação de ferro ferroso nas bactérias E.coli quando estas habitam ambientes anaeróbicos e de baixo pH ricos em ferro ferroso.
O operão feo na E.coli codifica três proteínas a FeoA, FeoB e a proteína FeoC.
A proteína FeoB é o principal componente deste sistema actuando como uma permease pela qual o ferro ferroso é transportado para o interior do citoplasma da bactéria.
A sua função de permease está dependente do seu domínio ”N-terminal G-protein” que possui actividade enzimática GTPase. A hidrolíse de GTP ocorre a uma taxa extremamente baixa e por isso é especulado que a proteína FeoA seja o factor utilizado para aumentar a sua taxa de hidrolíse.
Recentemente a função da FeoA foi esclarecida num artigo científico publicado em Junho de 2012 durante o decurso deste projecto. Revelou-se neste artigo que a proteína FeoA é essencial para a função da FeoB. Sem interacção entre as duas proteínas não ocorre o influxo de Fe2+ para citoplasma.
Para determinar a estrutura da proteína FeoA através de RMN foi necessário um longo processo de optimização das condições de expressão e purificação.
A analise de proteínas através de RMN pressupõe que estas estejam isotopicamente marcadas seja com 15N ou 15N /13C de forma a diminuir a complexidade dos espectros obtidos. Esta marcação só foi possivel através da expressão da proteína FeoA em meios marcados com os respectivos elementos químicos. Os meios mínimos foram utilizados neste processo visto que possibilitavam a substituição das fontes de carbono e nitrogénio pelos respectivos reagentes equivalentes (13C-Glucose e 15NH4Cl).
Durante o processo de optimização da purifição foi detectada a presença do dímero de FeoA (17kDa) em solução. Este resultado foi muito importante pois foi a primeira que foi detectada a presença do dímero de FeoA em solução, apesar de existirem algumas estruturas de FeoA em dímero cuja relevância fisiológica é ainda pouco clara.
A concentração total de proteína afecta a proporção do monómero e do dímero de FeoA. Foi também determinado ao longo deste projecto a impossibilidade de separar ambas as formas visto que se encontram num equilíbrio dinâmico.
Nas fases preliminares deste projecto foi produzida uma amostra cuja concentração era muito baixa 10uM que continha maioritariamente o monómero. Esta amostra era inicialmente mais concentrada mas com o tempo a amostra degradou-se e precipitou levando a uma diminuição da concentração total. Esta amostra apenas possibilitou a obtenção de um 1H-15N-HSQC que devido á sua diluição não permitiu a obtenção de espectros essenciais á determinação da estrutura.
O 1H-15N-HSQC obtido quando comparado com o 1H-15N-HSQC na qual se encontram ambas as formas possibilitou a distinção dos picos relativos ao monómero e ao dímero.
Para determinar a estrutura da FeoA foi utilizado o 1H-15N-HSQC como guia para identificar os picos em vários outros espectros. Os espectros HNCO,HN(CA)CO, HNCACB e HN(CO)CACB foram utilizados para a identificação dos átomos do backbone da proteína ao mesmo tempo que nos permitiram ligar os vários picos de acordo com a sequência da proteína FeoA.
Por outro lado os espectros 15N-TOCSY, hCCH-TOCSY, 1H-13C-HSQC permitiram a identificação dos átomos da cadeia lateral dos aminoácidos.
No fim este conjunto de picos identificados foram utilizados nos espectros NOESY que nos permitem identificar interaçãoes até um máximo de 5 A entre H-H. Esta informação permitiu-nos produzir a estrutura da FeoA ao fim de um longo processo de analise por parte de vários softwares e fases finais de refinamento.
A estrutura final da FeoA da E.coli possui uma estrutura SH3 domain-like fold semelhante á estrutura determinada através de cristalografia do organismo Stenotrophomonas maltophilia.
The goal of this project was to study the FeoA protein from E.coli, in terms of both structure and function as the title suggests. FeoA is a component of one of the major systems responsible for bacterial ferrous iron uptake, the Feo (ferrous iron-transport) system. In addition to FeoA it also contains the, FeoB and FeoC proteins. FeoB acts as a GTP dependent ferrous permease spanning the cytoplasmatic membrane of E.coli. Its N-terminal domain is a GTPase which regulates the ferrous influx. FeoC is believed to be a transcriptional activator or repressor which was recently found in in-vitro experiments to be directly interacting with FeoB potentially modulating its action. The FeoA function that is an important goal of this project was also further elucidated in June 2012 while this project was ongoing. It was shown in vivo that FeoA also interacts with FeoB protein being involved in its import of Fe (II). This agrees with our group’s hypothesis that the FeoA protein might stimulate the GTPase activity of FeoB. Our strategy was to probe the mode of interaction of the proteins of the feo operon in vitro using NMR spectroscopy. The first step in this task was to characterize each of its components. In order to determine the FeoA structure through NMR spectroscopy it was necessary to optimize its expression and purification conditions. During the process of purification it was reported for the first time the presence in solution of the FeoA homodimer. The FeoA monomer was structurally characterize by NMR analysis, where it was verified that the structure is an SH3-domain-like fold in agreement with the crystal structure (16). The residues affected by the dimerization were also determined by NMR.
The goal of this project was to study the FeoA protein from E.coli, in terms of both structure and function as the title suggests. FeoA is a component of one of the major systems responsible for bacterial ferrous iron uptake, the Feo (ferrous iron-transport) system. In addition to FeoA it also contains the, FeoB and FeoC proteins. FeoB acts as a GTP dependent ferrous permease spanning the cytoplasmatic membrane of E.coli. Its N-terminal domain is a GTPase which regulates the ferrous influx. FeoC is believed to be a transcriptional activator or repressor which was recently found in in-vitro experiments to be directly interacting with FeoB potentially modulating its action. The FeoA function that is an important goal of this project was also further elucidated in June 2012 while this project was ongoing. It was shown in vivo that FeoA also interacts with FeoB protein being involved in its import of Fe (II). This agrees with our group’s hypothesis that the FeoA protein might stimulate the GTPase activity of FeoB. Our strategy was to probe the mode of interaction of the proteins of the feo operon in vitro using NMR spectroscopy. The first step in this task was to characterize each of its components. In order to determine the FeoA structure through NMR spectroscopy it was necessary to optimize its expression and purification conditions. During the process of purification it was reported for the first time the presence in solution of the FeoA homodimer. The FeoA monomer was structurally characterize by NMR analysis, where it was verified that the structure is an SH3-domain-like fold in agreement with the crystal structure (16). The residues affected by the dimerization were also determined by NMR.
Descrição
Tese de mestrado em Bioquímica, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2012
Palavras-chave
Sistema Feo Sistema FeoA Ferro ferroso Fe2+ Tese de mestrado - 2012