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Genetic variability, disease severity and therapeutic response in a cohort of Angolan Sickle Cell Disease patients
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Autores
Resumo(s)
A Drepanocitose ou Anemia das Células Falciformes (ACF) é uma doença hereditária com
transmissão recessiva, causada pela mutação c.20A>T no gene HBB:. Origina uma variante
estrutural da hemoglobina adulta normal denominada de hemoglobina falciforme (HbS). Sob
condições de hipoxia, a solubilidade da HbS reduz para um quinto, comparativamente com a
hemoglobina adulta. Esta situação causa a polimerização da molécula de HbS com
consequente falciformação dos eritrócitos, tornando-os menos flexíveis e mais rígidos, e
propensos a eventos de vaso-oclusão e hemólise. As principais manifestações clínicas da ACF
são altamente heterogéneas e advém dos eventos de vaso-oclusão e hemólise, causando
anemia, isquemia e múltiplas crises de dor que requerem hospitalizações frequentes.
Os indivíduos homozigóticos para a HbS têm o fenótipo mais severo e têm uma prevalência
de aproximadamente 70% entre todos os indivíduos com ACF. Estes pacientes desenvolvem
uma anemia grave devido à ausência da produção de hemoglobina adulta por falta de síntese
de cadeias beta-globina normais. A ACF afeta mais de 300 000 recém-nascidos mundialmente
por ano, particularmente na África Subsariana, onde a incidência é de 75%. Esta doença é
bastante negligenciada, contabilizando uma taxa de mortalidade entre 50-90% em crianças
não diagnosticadas com menos de cinco anos de idade.
Apesar de ser uma doença monogénica, a ACF tem uma heterogeneidade clínica
notavelmente elevada na sua expressão fenotípica. Vários fatores demonstraram modular as
manifestações clínicas desta doença, nomeadamente moduladores genéticos como a alfa talassémia e os haplótipos da beta-globina, que modificam parâmetros biológicos como o grau
de anemia hemolítica ou os níveis de hemoglobina fetal (HbF). Os genes ZBTB7A e ZNF410
foram propostos como possíveis influenciadores da fisiopatologia da ACF.
O ZBTB7A é um regulador importante da transição da expressão de HbF para hemoglobina
adulta, atuando como um repressor de transcrição aquando da sua ligação ao promotor do
gene da gama-globina, responsável pela expressão de HbF. A potência de repressão do
ZBTB7A pode originar a perda de 50% da HbF.
Apesar da quantidade reduzida de estudos, sabe-se que o ZNF410 atua somente num alvo nas
células eritroides, que é responsável por silenciar a gama-globina e, consequentemente, inibir
a expressão de HbF. Dado que o ZNF410 e o ZBTB7A atuam no complexo co-repressor que
desempenha funções cruciais na troca de hemoglobinas, acredita-se que estes genes
representam uma influência considerável na síntese de HbF e, subsequentemente, nos
fenótipos da drepanocitose. Posto isto, destaca-se a importância de explorar e estudar novos
polimorfismos no ZBTB7A e ZNF410, que possam estar positivamente correlacionados com
os níveis de HbF na drepanocitose, severidade da doença e diferenciação de manifestações
clínicas.
O tratamento primário da ACF são as transfusões de sangue e estima-se que a maioria dos
pacientes com SCA tenham recebido pelo menos uma transfusão. Atualmente, existem quatro
medicamentos aprovados para o tratamento da ACF: Hidroxiureia, L-Glutamina,
Crizanlizumab-tmca e Voxelotor.
Tecnologias de edição genética como o CRISPR/Cas9 podem alterar permanentemente os
genes causadores de doenças, através da correção, exclusão, adição e interrupção de regiões específicas. Assim, este novo método de tratamento pode providenciar a cura para a maioria
dos doentes drepanocíticos. No entanto, questões de segurança necessitam de ser resolvidas
para garantir o seu uso clínico seguro.
O objetivo deste estudo é determinar e avaliar a frequência e influência de determinados
polimorfismos na severidade da doença e na resposta ao tratamento da ACF, numa população
de doentes pediátricos e adultos Africanos, acompanhados na consulta da drepanocitose na
Clínica Girassol, em Luanda, Angola. Adicionalmente, pretendemos definir a frequência
alélica e genotípica das principais variantes genéticas relacionadas com a drepanocitose,
nomeadamente o alelo S, haplótipos da beta-globina e variantes do gene BCL11A. Sendo um
marcador da ACF, serão analisadas as frequências alélica e genotípica da alfa-talassémia de
3,7kb. Com os dados obtidos, tencionamos realizar estudos de associação entre os marcadores
genéticos da drepanocitose e a severidade clínica da doença.
Neste estudo pretendemos identificar moduladores genéticos da ACF, através do estudo de
120 pacientes angolanos drepanocíticos acompanhados na consulta de drepanocitose na
Clínica Girassol em Luanda, Angola. Realizaram-se estudos de associação entre fenótipos
clínicos e parâmetros bioquímicos e hematológicos, bem como 12 variantes genéticas em 7
genes relacionados com a gravidade da doença (HBB, HBBP1, HBA, HBE, HBG1, ZBTB7A e
ZNF410). Moduladores genéticos conhecidos da ACF (alfa-talassémia e haplótipos da beta globina) e genes putativos modificadores de parâmetros hematológicos foram caracterizados,
e as diferenças na sua distribuição foram avaliadas. Adicionalmente, tencionamos relacionar a
resposta à terapia farmacológica com Hidroxiureia, com os marcadores genéticos estudados,
no decorrer de uma análise retrospetiva.
A presença da deleção alfa-talassémia de 3,7kb demonstrou-se protetora em fatores de
severidade da doença como a idade de diagnóstico, idade de manifestação dos primeiros
sintomas, número de transfusões de sangue recebidas, grau de anemia e ocorrência de crises
dolorosas. Neste estudo, observámos um aumento na prevalência do alelo com a deleção
relacionada com o envelhecimento, o que se confirmou por uma frequência de 50% de
pacientes heterozigóticos e 16,7% de homozigóticos para a deleção com idade superior a 20
anos.
No nosso projeto, verificou-se uma redução da percentagem de indivíduos a receber
tratamento com Hidroxiureia diretamente proporcional ao aumento da idade. Além disso,
observou-se que a maior percentagem corresponde a pacientes sem deleção. Deste modo, é
possível aferir que os pacientes mais velhos e, por consequente, com mais alelos da deleção,
não requerem tanto tratamento farmacológico como os indivíduos sem deleção, salientando a
componente protetora da alfa-talassémia de 3,7kb em doentes drepanocíticos.
O haplótipo CAR/CAR, predominante em indivíduos angolanos, foi o mais prevalente na
nossa população. É caracterizado por um fenótipo mais severo, corroborado no nosso estudo
por uma diminuição no número de indivíduos com este haplótipo com o aumento da idade,
sugerindo uma redução na sobrevivência. Confirmou-se a severidade nos indivíduos
CAR/CAR na idade de diagnóstico, necessidade de tratamento com Hidroxiureia, dactilite,
crises de dor e AVCs. Contrariamente ao esperado, pacientes CAR/SEN apresentaram maior
severidade na idade de manifestação de primeiros sintomas, necessidade de transfusões de
sangue e demonstração de sintomas da ACF.
Relativamente aos polimorfismos, a frequência de mutações no ZNF410 foi demasiado baixa
para tirar elações em análise estatística. Nos polimorfismos do ZBTB7A, verificou-se um
aumento na idade a que surgiram os primeiros sintomas em indivíduos com a mutação, bem
como redução nas crises de dor e anemia e vantagens hematológicas, designadamente o
aumento da concentração de HbF e de hemoglobina A2.
Este estudo fornece uma contribuição relevante para o conhecimento genético da população
angolana, na qual o haplótipo CAR é indiscutivelmente o mais comum, e a co-herança da
alfa-talassémia de 3,7kb tem um grande impacto na severidade clínica da ACF. Neste projeto
foram estudados, pela primeira vez, polimorfismos encontrados em genes abordados
recentemente e foram realizados estudos de associação entre esses polimorfismos e os
parâmetros que caracterizam o fenótipo dos pacientes drepanocíticos. Observaram-se
diferenças significativas em vários parâmetros clínicos e em alguns dados hematológicos, em
todos os polimorfismos estudados.
Ainda há um longo caminho a percorrer antes de entendermos completamente uma doença tão
complexa como a drepanocitose e o motivo pelo qual ela se manifesta de diferentes formas
nos pacientes. Esta heterogeneidade é, sem dúvida, influenciada pela herança genética dos
pacientes, mas esse não é o único fator. Deste modo, são necessários mais estudos para
corroborar os resultados obtidos e confirmar as nossas hipóteses acerca do impacto dos
polimorfismos na severidade clínica da ACF.
Sickle cell disease (SCD) is an inherited disease with recessive transmission caused by the mutation c.20A>T in the HBB gene. It results in a structural variant of normal adult haemoglobin (HbS). The main clinical manifestations of SCD include severe anaemia and multiple pain crises that require regular hospitalizations. Sickle cell anaemia (SCA) designates homozygosity for the HbS mutation and represents 70% of all SCD cases. SCA affects more than 300,000 newborns worldwide per year. This is a widely neglected disease, accounting for a mortality rate between 50-90% in undiagnosed children under five years old. Regardless of being a monogenic disease, SCA has a remarkably high clinical heterogeneity in its phenotypic expression. Several factors modulate the clinical manifestations of SCA, namely genetic markers such as alpha-thalassaemia and beta-globin haplotypes. Moreover, ZBTB7A and ZNF410 have been recently proposed as possible influencers of SCA pathophysiology. This project aims to identify genetic modifiers of the clinical course of SCA by studying 120 Angolan SCA patients followed at Clínica Girassol, in Luanda, Angola. Association studies were performed between the clinical outcomes, and haematological and biochemical parameters of patients, as well as with 12 genetic variants related to disease severity. Known genetic modulators of SCA and putative genetic modifiers of haematological parameters were characterized, and the differences in their distribution were assessed. The presence of 3.7kb α-thalassaemia deletion was found to be protective in disease severity factors, including the degree of anaemia and occurrence of painful crises. The CAR/CAR haplotype was the most prevalent in our population. It is characterized by a worse phenotype with the most severe disease outcomes. However, CAR/SEN patients had a worse prognosis in some clinical and haematological parameters. Individuals presenting variants in ZBTB7A SNPs had a milder phenotype. Notwithstanding, they were strongly associated with higher HbF levels, less symptoms and fewer pain events.
Sickle cell disease (SCD) is an inherited disease with recessive transmission caused by the mutation c.20A>T in the HBB gene. It results in a structural variant of normal adult haemoglobin (HbS). The main clinical manifestations of SCD include severe anaemia and multiple pain crises that require regular hospitalizations. Sickle cell anaemia (SCA) designates homozygosity for the HbS mutation and represents 70% of all SCD cases. SCA affects more than 300,000 newborns worldwide per year. This is a widely neglected disease, accounting for a mortality rate between 50-90% in undiagnosed children under five years old. Regardless of being a monogenic disease, SCA has a remarkably high clinical heterogeneity in its phenotypic expression. Several factors modulate the clinical manifestations of SCA, namely genetic markers such as alpha-thalassaemia and beta-globin haplotypes. Moreover, ZBTB7A and ZNF410 have been recently proposed as possible influencers of SCA pathophysiology. This project aims to identify genetic modifiers of the clinical course of SCA by studying 120 Angolan SCA patients followed at Clínica Girassol, in Luanda, Angola. Association studies were performed between the clinical outcomes, and haematological and biochemical parameters of patients, as well as with 12 genetic variants related to disease severity. Known genetic modulators of SCA and putative genetic modifiers of haematological parameters were characterized, and the differences in their distribution were assessed. The presence of 3.7kb α-thalassaemia deletion was found to be protective in disease severity factors, including the degree of anaemia and occurrence of painful crises. The CAR/CAR haplotype was the most prevalent in our population. It is characterized by a worse phenotype with the most severe disease outcomes. However, CAR/SEN patients had a worse prognosis in some clinical and haematological parameters. Individuals presenting variants in ZBTB7A SNPs had a milder phenotype. Notwithstanding, they were strongly associated with higher HbF levels, less symptoms and fewer pain events.
Descrição
Tese de mestrado, Ciências Biofarmacêuticas, 2022, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia.
Palavras-chave
Sickle cell anaemia 3.7kb alpha-thalassaemia deletion ZBTB7A ZNF410 Foetal haemoglobin Teses de mestrado - 2022