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Publicação
Metabolic-derived functions during adaptation of E. coli to the mammalian gut
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Resumo(s)
Mammals harbour a cosmos of microbes in their gastrointestinal tract throughout their life. This dense polymicrobial network is dominated by commensal bacteria that live mostly in harmony with their host. Disruption of this homeostasis is detrimental to nutrient acquisition and overall health of the host. Colonisation is the first step in persistence and/or infection in the GI tract, it is thus essential to understand how in vivo bacteria obtain energy, carbon and nitrogen to sustain their growth and resist elimination. This work focused on a particular species of enteric bacteria, by studying the best characterized Escherichia coli strain. Use of this commensal strain (K-12 MG1655) has been the most prevalent in recent studies, it is well characterised at the genetic level and has been studied in the intestinal environment. This worked was founded on the hypothesis that the establishment of a metabolic landscape compatible with the state and composition of the intestinal environment is an important pressure for E. coli, highlighting from an evolutionary scale the fundamental importance of metabolism for intestinal colonisation. Through the characterization of the genetic basis and the evolutionary and physiological effects of the predominant beneficial mutations during adaptation to the intestinal environment of mice, this work presents mechanistic evidence and novel insights on how bacteria can establish and persist in specific ecological settings of this complex ecosystem.
O trato gastrointestinal de mamíferos incorpora uma comunidade abundante e diversa de microrganismos, vulgarmente designada microbiota. Além de seres eucariotas e archaea, as bactérias constituem a vasta maioria da microbiota com números que se aproximam do total de células do próprio hospedeiro. Estes seres são transmitidos verticalmente da progenitora para os descendentes, acompanhando-os desde os primeiros dias de desenvolvimento. Esta fase constituída por uma microbiota intestinal mais simples assume, portanto, um papel importante no subsequente desenvolvimento de uma microbiota mais complexa, mas também na aprendizagem nutricional e imunitária de animais. Devido à abundância de nutrientes disponibilizados e à maior densidade energética da alimentação pós-desmame, o ecosistema intestinal, praticamente despopulado à nascença é extremamente propenso à colonisação por enterobactérias que aí se multiplicam e persistem em enormes densidades populacionais. A alteração da dieta à base de oligosacáridos derivados do leite para carbohidratos de origem vegetal, causam uma alteração abrupta nas bactérias presentes no intestino à medida que estas são substituídas por espécies mais aptas a utilizar os nutrientes presentes. Daí em diante, um vasto número de espécies de duas linhas filogenéticas em particular, colonisam praticamente todo este nicho. Estas bactérias estabelecem redes de interações que se admite serem de extrema complexidade devido à especificidade de cada espécie, compreendendo interações negativas como a produção de compostos antimicrobianos que inibem outras espécies ou interações positivas em que os produtos metabólicos finais de uma espécie servem de alimento a outras, por exemplo. De acordo com a hipótese nicho-nutriente, são principalmente as interações metabólicas entre cada espécie e o perfil nutricional do intestino que dita a composição da microbiota. Especificamente, o sucesso de uma espécie está dependente da capacidade de divisão ser superior à taxa a que é eliminada, utilizando para isso um ou um número baixo de nutrientes limitantes no intestino. Um resultado importante advém deste fenômeno. Qualquer espécie invasora tem necessariamente de ultrapassar esta barreira de forma a atingir uma população de dimensões suficientes para causar efeitos adversos ao hospedeiro, no caso de estirpes patogénicas. Para tal, estirpes invasoras ocupam nichos disponíveis ou competem com espécies comensais com preferências nutricionais coincidentes. Alternativamente, várias espécies patogénicas ou oportunistas disrompem a estabilidade da microbiota comensal através da indução de inflamação ou tiram vantagem do uso de antibióticos que abrem novos nichos previamente ocupados, de forma a colonizarem o seu hospedeiro. É, portanto, importante compreender como certas espécies subsistem no ambiente intestinal, não só estirpes que prejudicam a saúde do seu hospedeiro, mas também aquelas que, competindo por nichos semelhantes, o previnem. Ainda assim, as bactérias são organismos extremamente adaptáveis ao seu ambiente. Através da evolução experimental é possível monitorizar in vivo a sua adaptação ao ambiente intestinal e identificar e medir a importância relativa de certos mecanismos fisiológicos, a longo prazo. Este trabalho, incidiu sobre a adaptação de Escherichia coli ao trato intestinal de ratos. A estirpe K-12 MG1655 tem um genótipo bem caracterizado e constitui uma espécie com um metabolismo particularmente versátil, com vários exemplos de estirpes tanto patogénicas como comensais, sendo, portanto, um modelo de interesse neste ambiente. Após um mês de colonização in vivo, a base genética de mutações que presumivelmente teriam tornado a estirpe ancestral mais apta neste ambiente, foi identificada por sequenciação genómica. Neste trabalho, estendemos a caracterização das bases fisiológicas nos mutantes evoluídos e estabelecemos uma comparação entre a adaptação in vivo na presença e ausência de microbiota, de forma a explorar a importância relativa de certos mecanismos especificamente dependentes do ambiente intestinal a colonizar. Caracterizámos a adaptação desta estirpe de E. coli na ausência de outros membros da microbiota como tendo seguido um trajeto evolutivo no sentido de aumentar a capacidade de utilização de aminoácidos. Dos vários mutantes que suportam esta hipótese, selecionámos a mutação mais abundante e mais vezes identificada entre as várias experiências independentes, a disrupção do gene lrp. Através da comparação com uma estirpe mutante de referência mostrámos que inserções neste gene em mutantes evoluídos levou predominantemente à abolição da sua função, o que propusemos ter levado à sua vantagem seletiva: estas mutações levaram à perda de capacidade para crescer num meio em que a degradação de glicina, para o qual Lrp é ativador, seria necessária, visto a estirpe referência com lrp deletado também não crescer, ao contrário da estirpe ancestral. A partir deste fenótipo, desenvolvemos aqui um método high-throughput para a identificação de mutações no lrp. Através deste método, mostrámos que a cinética de adaptação desta mutação ocorreu posteriormente ao primeiro passo adaptativo já conhecido, com efeitos seletivos mais baixos e estabilizando a níveis intermédios na população. O padrão adaptativo que elucidamos é reminiscente do efeito de interferência clonal, em que mutantes lrp competem com outras mutações benéficas, limitando assim a fixação da população mutante lrp, embora seja importante caracterizar outros alvos adaptativos. A hipótese alternativa que propomos para explicar a estabilização a níveis intermédios da população mutante para o lrp seria que o nicho ocupado por estes é esgotado pela sua expansão, limitando assim a fixação deste alelo. Em concordância, observámos que quando uma estirpe a priori com lrp deletado foi introduzida in vivo, só foi selecionada após dez dias, o que coincide temporalmente com a expansão de novo e sugere que inicialmente a composição metabólica intestinal é alterada pela colonização, que posteriormente favorece mutantes com perda de função do lrp. Este gene está extensamente caracterizado no seu papel de regulador transcricional, particularmente para metabolismo de aminoácidos. De modo a encontrar um meio em que os mutantes lrp tivessem vantagem em relação à estirpe ancestral determinou-se o crescimento em vários meios. Através da análise das redes metabólicas reguladas pelo Lrp, previmos que especificamente para crescimento com os aminoácidos Alanina, Serina e Treonina, a perda de função do lrp fosse vantajosa. De facto, mostramos que na presença destes 3 substratos os mutantes lrp evoluídos têm vantagem seletiva, embora não num perfil de aminoácidos mais diverso, apontando para a importância do perfil nutricional especifico, principalmente no que diz respeito às diferentes proporções de aminoacidos. Na presença da microbiota, a análise funcional das mutações benéficas aponta para um trajeto adaptativo praticamente distinto do da mono colonização. Neste caso a maior parte das mutações apontam para um aumento da capacidade de utilização de açucares ou compostos semelhantes, o que pode advir da presença da microbiota. Na presença de uma microbiota abundante que também é capaz de consumir aminoácidos, é possível que as funções degradativas de outros membros da microbiota levem neste caso à disponibilidade de carbohidratos simples que E. coli consegue utilizar. A dependência pelo fornecimento de nutrientes por outras espécies, terá tornado o uso destes de uma forma energeticamente eficiente, crucial para o fitness de E. coli. Com esta hipótese, utilizámos duas mutações benéficas identificadas como correspondendo a genes funcionalmente relacionados com respiração anaeróbia para estudar a hipótese que o seu fitness seria mais elevado em condições anaeróbias. Dois mutantes com inserções na região regulatória dos operões dcuBfumB e focApflB, relacionados com a produção e transporte de fumarato e formato, respetivamente, foram competidos in vitro contra a estirpe ancestral, utilizando um meio que se aproximasse da composição de carbohidratos preferenciais in vivo. Estava já descrito que estes mutantes teriam uma maior expressão transcricional de cada operão. Mostrámos que nestas condições, fenotipicamente, os mutantes evoluídos apresentam uma vantagem seletiva, que terá resultado de uma maior produção e respiração de fumarato e formato, respetivamente. Um aceitador de eletrões alternativo foi também testado com a hipótese de que teria efeitos que diferenciassem os dois mutantes. Em suma, o presente trabalho reporta evidências de vários tipos de landscapes metabólicos que E. coli assume durante adaptação ao seu ambiente nativo. Quando é a primeira a colonizar, a ausência de degradação de fontes de carbono complexas favorece a utilização de aminoácidos. Na presença de microbiota, aminoácidos tornam-se limitantes e o fornecimento cruzado fornece carbohidratos simples, cuja respiração anaeróbia se torna essencial. Acima de tudo, os estudos aqui referidos demonstram um grande paralelismo na adaptação da E. coli ao intestino. A reprodutibilidade evolutiva no ambiente complexo do intestino mostra que a evolução paralela não está restrita aos ambientes de laboratório, mas pode também ser comum em ambientes “naturais”, de vasta complexidade. Por si só, este facto é de salientar.
O trato gastrointestinal de mamíferos incorpora uma comunidade abundante e diversa de microrganismos, vulgarmente designada microbiota. Além de seres eucariotas e archaea, as bactérias constituem a vasta maioria da microbiota com números que se aproximam do total de células do próprio hospedeiro. Estes seres são transmitidos verticalmente da progenitora para os descendentes, acompanhando-os desde os primeiros dias de desenvolvimento. Esta fase constituída por uma microbiota intestinal mais simples assume, portanto, um papel importante no subsequente desenvolvimento de uma microbiota mais complexa, mas também na aprendizagem nutricional e imunitária de animais. Devido à abundância de nutrientes disponibilizados e à maior densidade energética da alimentação pós-desmame, o ecosistema intestinal, praticamente despopulado à nascença é extremamente propenso à colonisação por enterobactérias que aí se multiplicam e persistem em enormes densidades populacionais. A alteração da dieta à base de oligosacáridos derivados do leite para carbohidratos de origem vegetal, causam uma alteração abrupta nas bactérias presentes no intestino à medida que estas são substituídas por espécies mais aptas a utilizar os nutrientes presentes. Daí em diante, um vasto número de espécies de duas linhas filogenéticas em particular, colonisam praticamente todo este nicho. Estas bactérias estabelecem redes de interações que se admite serem de extrema complexidade devido à especificidade de cada espécie, compreendendo interações negativas como a produção de compostos antimicrobianos que inibem outras espécies ou interações positivas em que os produtos metabólicos finais de uma espécie servem de alimento a outras, por exemplo. De acordo com a hipótese nicho-nutriente, são principalmente as interações metabólicas entre cada espécie e o perfil nutricional do intestino que dita a composição da microbiota. Especificamente, o sucesso de uma espécie está dependente da capacidade de divisão ser superior à taxa a que é eliminada, utilizando para isso um ou um número baixo de nutrientes limitantes no intestino. Um resultado importante advém deste fenômeno. Qualquer espécie invasora tem necessariamente de ultrapassar esta barreira de forma a atingir uma população de dimensões suficientes para causar efeitos adversos ao hospedeiro, no caso de estirpes patogénicas. Para tal, estirpes invasoras ocupam nichos disponíveis ou competem com espécies comensais com preferências nutricionais coincidentes. Alternativamente, várias espécies patogénicas ou oportunistas disrompem a estabilidade da microbiota comensal através da indução de inflamação ou tiram vantagem do uso de antibióticos que abrem novos nichos previamente ocupados, de forma a colonizarem o seu hospedeiro. É, portanto, importante compreender como certas espécies subsistem no ambiente intestinal, não só estirpes que prejudicam a saúde do seu hospedeiro, mas também aquelas que, competindo por nichos semelhantes, o previnem. Ainda assim, as bactérias são organismos extremamente adaptáveis ao seu ambiente. Através da evolução experimental é possível monitorizar in vivo a sua adaptação ao ambiente intestinal e identificar e medir a importância relativa de certos mecanismos fisiológicos, a longo prazo. Este trabalho, incidiu sobre a adaptação de Escherichia coli ao trato intestinal de ratos. A estirpe K-12 MG1655 tem um genótipo bem caracterizado e constitui uma espécie com um metabolismo particularmente versátil, com vários exemplos de estirpes tanto patogénicas como comensais, sendo, portanto, um modelo de interesse neste ambiente. Após um mês de colonização in vivo, a base genética de mutações que presumivelmente teriam tornado a estirpe ancestral mais apta neste ambiente, foi identificada por sequenciação genómica. Neste trabalho, estendemos a caracterização das bases fisiológicas nos mutantes evoluídos e estabelecemos uma comparação entre a adaptação in vivo na presença e ausência de microbiota, de forma a explorar a importância relativa de certos mecanismos especificamente dependentes do ambiente intestinal a colonizar. Caracterizámos a adaptação desta estirpe de E. coli na ausência de outros membros da microbiota como tendo seguido um trajeto evolutivo no sentido de aumentar a capacidade de utilização de aminoácidos. Dos vários mutantes que suportam esta hipótese, selecionámos a mutação mais abundante e mais vezes identificada entre as várias experiências independentes, a disrupção do gene lrp. Através da comparação com uma estirpe mutante de referência mostrámos que inserções neste gene em mutantes evoluídos levou predominantemente à abolição da sua função, o que propusemos ter levado à sua vantagem seletiva: estas mutações levaram à perda de capacidade para crescer num meio em que a degradação de glicina, para o qual Lrp é ativador, seria necessária, visto a estirpe referência com lrp deletado também não crescer, ao contrário da estirpe ancestral. A partir deste fenótipo, desenvolvemos aqui um método high-throughput para a identificação de mutações no lrp. Através deste método, mostrámos que a cinética de adaptação desta mutação ocorreu posteriormente ao primeiro passo adaptativo já conhecido, com efeitos seletivos mais baixos e estabilizando a níveis intermédios na população. O padrão adaptativo que elucidamos é reminiscente do efeito de interferência clonal, em que mutantes lrp competem com outras mutações benéficas, limitando assim a fixação da população mutante lrp, embora seja importante caracterizar outros alvos adaptativos. A hipótese alternativa que propomos para explicar a estabilização a níveis intermédios da população mutante para o lrp seria que o nicho ocupado por estes é esgotado pela sua expansão, limitando assim a fixação deste alelo. Em concordância, observámos que quando uma estirpe a priori com lrp deletado foi introduzida in vivo, só foi selecionada após dez dias, o que coincide temporalmente com a expansão de novo e sugere que inicialmente a composição metabólica intestinal é alterada pela colonização, que posteriormente favorece mutantes com perda de função do lrp. Este gene está extensamente caracterizado no seu papel de regulador transcricional, particularmente para metabolismo de aminoácidos. De modo a encontrar um meio em que os mutantes lrp tivessem vantagem em relação à estirpe ancestral determinou-se o crescimento em vários meios. Através da análise das redes metabólicas reguladas pelo Lrp, previmos que especificamente para crescimento com os aminoácidos Alanina, Serina e Treonina, a perda de função do lrp fosse vantajosa. De facto, mostramos que na presença destes 3 substratos os mutantes lrp evoluídos têm vantagem seletiva, embora não num perfil de aminoácidos mais diverso, apontando para a importância do perfil nutricional especifico, principalmente no que diz respeito às diferentes proporções de aminoacidos. Na presença da microbiota, a análise funcional das mutações benéficas aponta para um trajeto adaptativo praticamente distinto do da mono colonização. Neste caso a maior parte das mutações apontam para um aumento da capacidade de utilização de açucares ou compostos semelhantes, o que pode advir da presença da microbiota. Na presença de uma microbiota abundante que também é capaz de consumir aminoácidos, é possível que as funções degradativas de outros membros da microbiota levem neste caso à disponibilidade de carbohidratos simples que E. coli consegue utilizar. A dependência pelo fornecimento de nutrientes por outras espécies, terá tornado o uso destes de uma forma energeticamente eficiente, crucial para o fitness de E. coli. Com esta hipótese, utilizámos duas mutações benéficas identificadas como correspondendo a genes funcionalmente relacionados com respiração anaeróbia para estudar a hipótese que o seu fitness seria mais elevado em condições anaeróbias. Dois mutantes com inserções na região regulatória dos operões dcuBfumB e focApflB, relacionados com a produção e transporte de fumarato e formato, respetivamente, foram competidos in vitro contra a estirpe ancestral, utilizando um meio que se aproximasse da composição de carbohidratos preferenciais in vivo. Estava já descrito que estes mutantes teriam uma maior expressão transcricional de cada operão. Mostrámos que nestas condições, fenotipicamente, os mutantes evoluídos apresentam uma vantagem seletiva, que terá resultado de uma maior produção e respiração de fumarato e formato, respetivamente. Um aceitador de eletrões alternativo foi também testado com a hipótese de que teria efeitos que diferenciassem os dois mutantes. Em suma, o presente trabalho reporta evidências de vários tipos de landscapes metabólicos que E. coli assume durante adaptação ao seu ambiente nativo. Quando é a primeira a colonizar, a ausência de degradação de fontes de carbono complexas favorece a utilização de aminoácidos. Na presença de microbiota, aminoácidos tornam-se limitantes e o fornecimento cruzado fornece carbohidratos simples, cuja respiração anaeróbia se torna essencial. Acima de tudo, os estudos aqui referidos demonstram um grande paralelismo na adaptação da E. coli ao intestino. A reprodutibilidade evolutiva no ambiente complexo do intestino mostra que a evolução paralela não está restrita aos ambientes de laboratório, mas pode também ser comum em ambientes “naturais”, de vasta complexidade. Por si só, este facto é de salientar.
Descrição
Tese de mestrado, Biologia Molecular e Genética, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2016
Palavras-chave
Mamíferos Microbiota E. coli Evolução Metabolismo Teses de mestrado - 2016