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Anticancer potential of Azurin interaction with lipid rafts: deciphering the Role of Caveolae
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Resumo(s)
O cancro é uma das principais doenças no mundo que pode levar à morte. Por ano, milhões de pessoas são diagnosticadas e mais de metade morre com esta doença. Ao longo de várias décadas, diversos tratamentos alternativos à quimioterapia e radioterapia têm sido desenvolvidos no sentido de ultrapassar os problemas que estes tratamentos convencionais causam, nomeadamente os seus efeitos adversos associados com a sua elevada toxicidade sistémica. Uma das possíveis alternativas que o campo da investigação tem vindo a seguir direcciona-se para factores, alguns solúveis, segregados por bactérias como enzimas, metabolitos secundários, toxinas, proteínas e péptidos derivados, que actuam especificamente nas células cancerígenas, sendo potenciais agentes anticancerígenos (Yamada et al., 2002a; Bernardes et al., 2010). Um exemplo destes factores é uma pequena proteína solúvel em água, secretada por Pseudomonas aeruginosa, designada azurina com 128 aminoácidos e um peso molecular de 14 kDa (Yamada et al., 2005; Bernardes et al., 2013). Existem muitos factores que suportam o potencial existente para a azurina poder actuar como um agente anticancerígeno. Um deles é que esta entra preferencialmente em células cancerígenas (Yamada et al., 2005). Para além disto, após a sua administração, não foram observados efeitos secundários em estudos in vivo (Choi et al., 2011; Warso et al., 2013). Esta proteína bacteriana pode mediar interacções específicas de elevada afinidade com várias proteínas das células humanas, conferindo-lhe a propriedade de proteína “molde”, que é provavelmente uma das suas características mais importantes (Fialho et al., 2007). Esta capacidade para actuar em múltiplos alvos é importante devido ao facto de poder ser mais difícil as células cancerígenas adquirirem resistência a este tratamento. Outra vantagem é que a azurina é uma molécula solúvel em água com um domínio hidrofóbico, que pode contribuir para a sua entrada nos tecidos e na eliminação para a corrente sanguínea (Kamp et al., 1990). Por último, esta proteína pode ser facilmente superexpressa em Escherichia coli, o que torna os processos de produção e purificação muito mais baratos (Bernardes et al., 2013). O mecanismo de entrada da azurina nas células não é, no entanto, totalmente compreendido. Estudos sugerem que esta penetra a membrana plasmática por uma via endocítica mediada por caveolae, que são jangadas lípidicas não planares (Taylor et al., 2009). As jangadas lipídicas têm concentrações elevadas de ácidos gordos saturados, de esfingolípidos (incluindo esfingomielina, ceramida e gangliósidos como o GM1), e de colesterol (Quest et al., 2008; Martinez-Outschoorn et al., 2015). Estes microdomínios membranares são pequenos, dinâmicos, heterogéneos e conseguem recrutar certas classes de proteínas. Estão ainda implicados em vários processos celulares fisiológicos, tais como tráfico de proteínas pela membrana, transdução de sinal, transporte de colesterol, organização do citoesqueleto, motilidade, polaridade e endocitose (Simons and Toomre, 2000; Martinez-Outschoorn et al., 2015). Para além disto, sabe-se ainda que em melanomas e cancros da próstata e mama, as jangadas lipídicas estão em maior número, sugerindo que estas estruturas desempenham um papel funcional durante a tumorigénese (Irwin et al., 2011; Murai, 2015). Com isto, o estudo destas estruturas é importante para a prevenção e tratamento do cancro, uma vez que estas estão envolvidas na progressão da doença (Murai, 2015). Existem dois tipos de jangadas lipídicas: jangadas lipídicas planares, que não têm características morfológicas específicas, e jangadas lipídicas não planares que, como foi referido anteriormente, são as caveolae. No primeiro caso, a proteína constituinte destes microdomínios é a flotilina (Martinez-Outschoorn et al., 2015), enquanto que no segundo caso, são as caveolinas e as cavinas (Parton et al., 2006; Parton and del Pozo, 2013). Actualmente sabe-se que as caveolae tem um papel importante no cancro. Nestes microdomínios, a activação de cascatas de sinalização pode alterar a morfologia e o comportamento das células (Martinez-Outschoorn et al., 2015). A “hipótese de sinalização de caveolae” implica uma das suas proteínas constituintes obrigatórias, a caveolina-1, na integração de várias vias moleculares (Patani et al., 2012). A capacidade desta proteína em modular a sinalização intra-celular tem implicações importantes em vários estados patológicos e biológicos humanos, incluindo a tumorigénese. Na verdade, durante os últimos 20 anos, vários estudos foram feitos investigando o papel da caveolina-1 na iniciação e progressão do cancro, mostrando que esta proteína multifuncional regula diversos processos associados a esta doença, tais como transformação de células, crescimento de tumores, migração celular, invasão, resistência a múltiplas drogas e angiogénese (Senetta et al., 2013). A compreensão do papel da caveolina-1 no desenvolvimento e progressão do cancro pode ser significativa para melhorar o prognóstico do paciente e prevenir o aparecimento desta doença. Para além das vantagens da aplicação da azurina no tratamento do cancro descritas anteriormente, a utilização desta ou de péptidos seus derivados em combinação com fármacos quimioterapêuticos potencia o efeito anticancerígeno destes. Com isto, problemas como a aquisição de resistência ou toxicidade produzidos pela administração sucessiva destes químicos podem ser ultrapassados, uma vez que passam a ser administrados em doses baixas (Bernardes et al., 2016; Yamada et al., 2016). Neste projecto de investigação, foram utilizadas três linhas celulares cancerígenas humanas: MCF-7 que corresponde a uma linha celular cancerígena de mama, HT-29 que é uma linha cancerígena de cólon e A549 que são células cancerígenas de pulmão. O objectivo principal deste trabalho é esclarecer o potencial anticancerígeno resultante da interacção entre a azurina com as jangadas lipídicas, decifrando o papel de caveolae. Neste estudo, demonstrámos que a azurina leva a um padrão de internalização das jangadas lipídicas, que consequentemente poderá remover receptores da superfície celular, que estão envolvidos na tumorigénese. Também verificámos que um dos primeiros passos de reconhecimento das células cancerígenas pela azurina dá-se ao nível do gangliósido GM1, que está localizado nas jangadas lipídicas. De seguida, observámos também que o silenciamento da expressão da caveolina-1 leva a uma diminuição, pelo menos em parte, da entrada da azurina nas células. Para além disso, foi possível verificar por técnicas de espectroscopia “in vitro”, que existe uma interacção física directa entra a azurina e um domínio funcional da caveolina-1, que é bastante importante na interacção com outras proteínas. O mesmo não se verifica para uma proteína mutante da azurina, onde foi operada a substituição de um aminoácido da sua estrutura nativa, identificando assim uma possível localização preferencial dentro da estrutura da azurina responsável pela interação desta com vários componentes dos microdomínios membranares. Por último, administrámos azurina em conjunto com fármacos quimioterapêuticos (paclitaxel e doxorrubicina) nas células cancerígenas, e observámos que no geral, a acção terapêutica destes é beneficiada, levando a maiores níveis de morte celular. Todos estes resultados elucidam sobre os mecanismos de entrada da azurina nas células cancerígenas, e mostram que esta proteína pode melhorar os efeitos de fármacos quimioterapêuticos que se encontram em uso clínico, e para os quais os doentes com cancro desenvolvem frequentemente resistência, dificultando a sua resposta terapêutica.
Azurin, a protein produced by Pseudomonas aeruginosa, acts as an anticancer agent. Studies suggest that this bacterial protein enters in cancer cells through the penetration of the plasma membrane via caveolae-mediated endocytic pathways. Caveolae are non-planar lipid rafts characterized by an abundance of caveolin and cavin proteins and it is known that the levels of lipid rafts are increased in melanomas, prostate, and breast cancers suggesting that these structures play a functional role during tumorigenesis. In this project, three human cancer cell models have been used: the MCF-7 breast cancer cell line, the HT-29 colon cancer cell line and the A549 lung cancer cell line with the main objective to clarify the anticancer potential of azurin interaction with lipid rafts, deciphering the role of caveolae. In this work, we demonstrate that azurin leads to a pattern of internalization of lipid rafts, through the staining of GM-1, a constituent of lipid rafts, with the Alexa488-labeled CtxB marker. We also show evidences that azurin recognizes cancer cells through the GM1 ganglioside which is located in lipid rafts, since its blockage with CtxB prevents the normal entry process of azurin in cancer cells. Then, we observed that silencing of Cav1 expression leads to a decrease at least in part, on the entry azurin in cells. In addition, it was verified by spectroscopic "in vitro" techniques, that there is a direct physical interaction between azurin and a functional domain of Cav1, which is very important in interacting with other proteins. The same is not true for an azurin mutant protein, which was operated at an amino acid substitution of its native structure, identifying a possible region within the sequence of azurin that may be of major importance for this mechanism. Finally, we combined the azurin with chemotherapeutic drugs, such as paclitaxel and doxorubicin, and observed that in general, the therapeutic action of these is benefited, leading to higher levels of cell death than when the drugs are added alone. In general, all these results elucidate on the azurin entry mechanisms in cancer cells, and show that azurin may be relevant as an adjuvant to improve the effects of other anticancer agents already in clinical use, to which patients often develop resistance hampering its full therapeutic response.
Azurin, a protein produced by Pseudomonas aeruginosa, acts as an anticancer agent. Studies suggest that this bacterial protein enters in cancer cells through the penetration of the plasma membrane via caveolae-mediated endocytic pathways. Caveolae are non-planar lipid rafts characterized by an abundance of caveolin and cavin proteins and it is known that the levels of lipid rafts are increased in melanomas, prostate, and breast cancers suggesting that these structures play a functional role during tumorigenesis. In this project, three human cancer cell models have been used: the MCF-7 breast cancer cell line, the HT-29 colon cancer cell line and the A549 lung cancer cell line with the main objective to clarify the anticancer potential of azurin interaction with lipid rafts, deciphering the role of caveolae. In this work, we demonstrate that azurin leads to a pattern of internalization of lipid rafts, through the staining of GM-1, a constituent of lipid rafts, with the Alexa488-labeled CtxB marker. We also show evidences that azurin recognizes cancer cells through the GM1 ganglioside which is located in lipid rafts, since its blockage with CtxB prevents the normal entry process of azurin in cancer cells. Then, we observed that silencing of Cav1 expression leads to a decrease at least in part, on the entry azurin in cells. In addition, it was verified by spectroscopic "in vitro" techniques, that there is a direct physical interaction between azurin and a functional domain of Cav1, which is very important in interacting with other proteins. The same is not true for an azurin mutant protein, which was operated at an amino acid substitution of its native structure, identifying a possible region within the sequence of azurin that may be of major importance for this mechanism. Finally, we combined the azurin with chemotherapeutic drugs, such as paclitaxel and doxorubicin, and observed that in general, the therapeutic action of these is benefited, leading to higher levels of cell death than when the drugs are added alone. In general, all these results elucidate on the azurin entry mechanisms in cancer cells, and show that azurin may be relevant as an adjuvant to improve the effects of other anticancer agents already in clinical use, to which patients often develop resistance hampering its full therapeutic response.
Descrição
Tese de mestrado, Biologia Humana e Ambiente, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2016
Palavras-chave
Azurina Potencial anticancerígeno Jangadas lipídicas Caveolae Fármacos quimioterapêuticos Teses de mestrado - 2016