Publicação
Development of Phenylalanine Hydroxylase Enzymosomes for the treatment of Phenylketonuria
| datacite.subject.fos | Ciências da Saúde | pt_PT |
| dc.contributor.advisor | Leandro, Ana Paula Costa dos Santos Peralta | |
| dc.contributor.advisor | Corvo, Luisa | |
| dc.contributor.author | Dias, Adriana dos Santos | |
| dc.date.accessioned | 2022-08-11T12:06:10Z | |
| dc.date.available | 2024-01-25T01:34:10Z | |
| dc.date.issued | 2021-01-25 | |
| dc.date.submitted | 2020-12-18 | |
| dc.description | Tese de mestrado, Ciências Biofarmacêuticas, 2021, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia | pt_PT |
| dc.description.abstract | A fenilcetonúria (PKU) é a doença genética rara que afeta com maior prevalência o metabolismo de aminoácidos. Esta doença é causada por mutações que afetam o gene PAH que codifica para a enzima fenilalanina hidroxilase humana (hPAH), expressa maioritariamente nos hepatócitos. Esta proteína é responsável pela conversão de fenilalanina (L-Phe) em tirosina (L-Tyr) na presença do cofator tetrahidrobiopterina (BH4), oxigénio molecular e de Fe(II) não hemíco presente no centro ativo. Atualmente, continua a haver urgência no desenvolvimento de novas terapias para a PKU, sendo que as frequentemente utilizadas envolvem uma restrição alimentar (terapia dietética) e a suplementação com o cofator BH4. A hPAH é um homotetrâmero em que cada subunidade (≈ 50 kDa) apresenta um domínio regulador N-terminal, um domínio catalítico e um domínio de oligomerização C-terminal responsável pela dimerização e consequente tetramerização. Uma terapia de reposição enzimática (ERT) envolvendo a administração de hPAH é presentemente um desafio devido em parte à instabilidade da proteína (elevada sensibilidade às condições do meio), à elevada massa molecular (≈200 kDa), necessidade da presença de tetrâmeros e do cofactoe enzimático exercer a sua função no ambiente biológico. Uma solução atrativa para ultrapassar estes constrangimentos envolve a formulação da proteína mantendo a sua estabilidade e funcionalidade e de um bom sistema de distribuição biofarmacológica, como os enzimossomas. Neste trabalho são apresentados os resultados obtidos na otimização das condições de modificação da hPAH para futuramente ligar covalentemente a enzima a lipossomas vazios produzindo enzimossomas. A hPAH recombinante foi expressa em E. coli e purificada através do recurso a uma cromatografia de afinidade com iões imobilizados. As espécies tetraméricas, posteriormente isoladas por cromatografia de exclusão molecular, foram modificadas usando diferentes razões de agente modificador:hPAH (8:1; 16:1 e 24:1), sendo utilizado como agente modificador o N-succinimidil S-acetiltioacetato (SATA). A hPAH modificada foi isolada e caracterizada em termos de rendimento de proteína recuperada, grau de modificação, atividade enzimática com pré-ativação por L-Phe, termoestabilidade e conformação quaternária. Através da comparação dos resultados obtidos com os da hPAH não-modificada, mas sujeita às mesmas condições reacionais da proteína modificada, observou-se alterações mínimas na atividade enzimática e um ligeiro aumento na termoestabilidade (parâmetro Tm) da proteína modificada. Estes dados indicam que a hPAH modificada preserva a sua função catalítica e estabilidade. Este trabalho permitiu assim estabelecer as condições experimentais para no futuro ligar covalentemente a proteína modificada a lipossomas vazios formando enzimosomas. | pt_PT |
| dc.description.abstract | Phenylketonuria (PKU) is the most prevalent genetic disorder of the amino acid metabolism, and is due to mutations affecting the PAH gene which encodes for human phenylalanine hydroxylase (hPAH), manly expressed in hepatocytes. This protein is responsible for the conversion of phenylalanine (L-Phe) into tyrosine (L-Tyr) in the presence of tetrahydrobiopterin (BH4) as the cofactor, Fe(II) and molecular oxygen. Presently, more efficient therapies are still needed, being dietetic restriction and cofactor supplementation the main available approaches to treat PKU patients. Human PAH is a homotetrameric enzyme with each subunit (≈ 50 kDa) presenting an N-terminal regulatory domain, a catalytic domain and a C-terminal oligomerization domain responsible for dimerization and subsequent tetramerization. An enzyme reposition therapy (ERT) involving hPAH administration is challenging mainly due to the protein instability (high sensitivity to environment conditions), high molecular mass (≈200 kDa), necessary maintenance of the biologic tetrameric state and need for the cofactor. An attractive approach to overcome these constraints involves the formulation of a stable protein as well the design of a drug delivery system, namely as enzymosomes. In this work, the procedures performed to optimize the assay conditions for hPAH modification for further covalent attach the enzyme to empty liposomes producing enzymosome are described. To reach this goal, recombinant hPAH was produced in E. coli and purified using an immobilized metal affinity chromatography. The homotetrameric species, isolated by size exclusion chromatography, were modified using different ratios of modifier agent:hPAH (8:1; 16:1 and 24:1) using N-succinimidyl S-acethylthioacetate (SATA) as the modifier agent. The successfully modified hPAH was isolated and tested for protein recovery, degree of modification, enzymatic activity with L-Phe pre-activation, thermostability, and quaternary structure. By comparing the obtained data with those found for the nonmodified hPAH, minimal changes in the enzymatic activity and a slight increase in the melting temperature (Tm) of the modified hPAH were observed. These data demonstrate that the modified protein preserves the catalytic function and stability. It is now possible to continue the studies and covalently attach the modified hPAH to liposome preparations thus obtaining enzymosomes. | pt_PT |
| dc.description.sponsorship | Com o patrocínio da Faculdade de Farmácia, Universidade de Lisboa. | pt_PT |
| dc.identifier.tid | 202991890 | pt_PT |
| dc.identifier.uri | http://hdl.handle.net/10451/54111 | |
| dc.language.iso | eng | pt_PT |
| dc.subject | Human phenylalanine hydroxylase | pt_PT |
| dc.subject | Phenylketonuria | pt_PT |
| dc.subject | Enzyme reposition therapy | pt_PT |
| dc.subject | Enzymosomes | pt_PT |
| dc.subject | Protein acetylthyolation | pt_PT |
| dc.subject | Teses de mestrado -2021 | pt_PT |
| dc.title | Development of Phenylalanine Hydroxylase Enzymosomes for the treatment of Phenylketonuria | pt_PT |
| dc.type | master thesis | |
| dspace.entity.type | Publication | |
| rcaap.embargofct | Parte do trabalho aguarda a publicação de um artigo científico. | pt_PT |
| rcaap.rights | openAccess | pt_PT |
| rcaap.type | masterThesis | pt_PT |
| thesis.degree.name | Mestrado em Ciências Biofarmacêuticas | pt_PT |