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Personalised treatment for Cystic Fibrosis patients with rare CFTR mutations
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Resumo(s)
A Fibrose Quística (FQ) é a doença autossómica recessiva mais comum em caucasianos. É causada
por variantes no gene CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator). Este gene
codifica uma proteína transmembranar, a CFTR, que está envolvida no transporte de cloreto (Cl-
) e
bicarbonato (HCO3
-
) através da membrana plasmática apical das células epiteliais. A CFTR
disfuncional provoca uma anomalia no transporte destes aniões, que por sua vez afetam a secreção de
fluidos. Isto leva a um desequilíbrio na homeostase dos fluidos em vários órgãos e tecidos epiteliais,
tais como as vias respiratórias, o sistema digestivo, as glândulas sudoríparas e o aparelho reprodutivo
(sobretudo o masculino). No entanto, a doença das vias respiratórias é a principal causa de
morbilidade e mortalidade nos indivíduos com FQ. Esta é marcada por uma insuficiente limpeza
mucociliar que resulta em ciclos recorrentes de infeção, inflamação e cicatrização, conduzindo
gradualmente ao declínio da função pulmonar. A proteína CFTR pertence à superfamília dos
transportadores ABC (ATP binding cassette), cujos membros são responsáveis pelo transporte de
substratos através das membranas celulares, normalmente contra um gradiente de concentração,
utilizando para tal a hidrólise do ATP. A CFTR é constituída por cinco domínios: dois domínios
transmembranares (TMD1 e TMD2), dois domínios de ligação ao nucleótido (NBD1 e NBD2) e um
domínio regulador (RD). Os domínios TMD1 e TMD2 criam o canal da proteína CFTR e os domínios
NBD1 e NBD2 ligam-se ao ATP e regulam a abertura e o fecho do canal. Como o canal da CFTR é
dependente do ATP, requer a fosforilação do RD pela proteína cinase A (PKA) e ligação do ATP aos
domínios NBD, o que causa a sua dimerização e permite o fluxo dos iões Cl-
/HCO3
-
através da
membrana apical das células epiteliais. O canal fecha quando ocorre a hidrólise do ATP, o que resulta
na separação do dímero NBD e na recuperação da conformação dos domínios TMD. Mais de 2.000
variantes foram já identificadas até ao momento no gene CFTR e agrupadas em sete classes com base
no seu impacto na expressão/função da proteína CFTR. As variantes que pertencem à classe I são
nonsense resultando assim num defeito na produção de proteína, causado pela introdução de um codão
stop prematuro. A classe II contém variantes que causam um processamento e tráfego anormal da
proteína CFTR, o que leva a uma proteína com um folding incorreto que é degradada prematuramente.
A classe III é constituída por variantes que influenciam a regulação da abertura do canal da CFTR,
afetando a sua ativação por ATP. As variantes da classe IV diminuem o fluxo de iões no canal,
reduzindo assim a sua condutância. A classe V é composta por variantes que reduzem a quantidade de
canais da CFTR na membrana plasmática, principalmente por causa de splicings alternativos, mas
ainda apresentam alguma função residual da CFTR. A classe VI está relacionada com uma
desestabilização da CFTR na membrana plasmática, reduzindo a quantidade de proteína na membrana.
As variantes da classe VII não produzem RNA mensageiro (mRNA) funcional da CFTR e não se
conseguem recuperar farmacologicamente. Variantes pertencentes às classes I, II, III e VII
normalmente resultam em fenótipos mais graves enquanto que variantes das classes IV, V e VI
permitem alguma função residual, originando formas atípicas de FQ. As variantes que são raras
também se chamam variantes órfãs. Estas apresentam uma previsão difícil da doença porque os seus
defeitos funcionais não foram definidos. Por serem raras, o desenvolvimento de novas terapias não é
direcionado para a sua correção. Na última década, foi aprovado o uso de pequenas moléculas na
clínica para o tratamento de indivíduos com FQ com variantes da CFTR específicas. Estes compostos
incluem o VX-770, também conhecido como ivacaftor (Kalydeco®), que atua como potenciador do
canal CFTR. Além deste fármaco, existem outros que são combinações deste potenciador com
corretores (como o VX-661 e o VX-445) concebidos para tratar os defeitos de folding e de tráfego
associados à variante mais comum, p.Phe508del. O VX-661 (tezacaftor) combinado com o ivacaftor é
conhecido como Symkevi® (Symdeko® nos EUA). A combinação tripla, aprovada mais recentemente
e conhecida como Kaftrio® (Trikafta® nos EUA), consiste no potenciador ivacaftor (VX-770) com dois corretores, tezacaftor (VX-661) e elexacaftor (VX-445). No entanto, estas terapias altamente
eficazes como moduladoras da CFTR foram desenvolvidas para indivíduos com FQ com as variantes
mais comuns da CFTR. Por isso, os indivíduos com FQ portadores de variantes raras (ou órfãs) não
são elegíveis para estes tratamentos, apesar de poderem beneficiar clinicamente dos mesmos. Por este
motivo, é necessário disponibilizar terapias personalizadas para indivíduos com FQ com variantes
raras (órfãs) da CFTR. Para tal, têm sido criados alguns modelos que ajudam a prever a eficácia dos
moduladores, como os organoides intestinais 3D, que são obtidos através do isolamento de criptas de
biópsias retais. Estes modelos de organoides 3D são fundamentais para o desenvolvimento de
tratamentos personalizados, pois permitem que muitas pessoas possam usufruir das terapias que já se
encontram no mercado, mas que não foram originalmente desenhadas para os seus genótipos. As
criptas intestinais contêm vários tipos de células, incluindo células estaminais. Estas encontram-se
usualmente na base das criptas e têm a capacidade de se diferenciarem noutras células. Quando as
criptas intestinais são mantidas em cultura nas condições apropriadas, podem gerar organoides
intestinais, estruturas 3D que imitam a composição e o comportamento do intestino. Quando os
organoides intestinais são gerados a partir de biópsias de indivíduos com variantes raras da CFTR,
podem ser usados para testar compostos num contexto personalizado para esse indivíduo. As respostas
clínicas às terapias com moduladores podem ser previstas em organoides intestinais derivados de
indivíduos com FQ utilizando o ensaio FIS (Forskolin Induced Swelling), que mede a função da CFTR
através do inchamento dos organoides quando estimulados por forscolina, que é um agonista da
CFTR. Os corretores, VX-445 e VX-661, são adicionados no dia anterior à experiência enquanto que o
potenciador, VX-770, é adicionado no próprio dia. A forscolina aumenta o cAMP intracelular, pois
ativa a PKA, que fosforila a CFTR, abrindo o canal e permitindo a passagem de água e de iões,
ativando assim a CFTR, que estimula a secreção de fluido para o lúmen do organoide.
Consequentemente, os organoides incham pela entrada de fluido. Quando a CFTR está ausente ou
disfuncional não induz o inchamento dos organoides, pois este é dependente da atividade da CFTR.
Este teste pode ser usado para testar o efeito dos moduladores nas variantes CFTR.
Este projeto de Mestrado teve como objetivo ajudar a trazer terapias personalizadas para indivíduos
portugueses com variantes raras da FQ, que não são elegíveis para receber os medicamentos
moduladores da CFTR atualmente aprovados. Para tal, a atividade intrínseca da CFTR de organoides
intestinais previamente gerados a partir de biópsias retais desses indivíduos com FQ com variantes
órfãs foi estudada. Os organoides intestinais são um ótimo material para este tipo de estudos porque
conseguem replicar a morfologia e a fisiologia do intestino, incluindo os vários tipos de células e as
interações entre elas. De modo a se poder prever a resposta clínica dos moduladores aprovados, estes
foram testados em organoides intestinais de indivíduos com variantes raras utilizando o ensaio FIS
para determinar a melhor terapia para cada indivíduo, numa abordagem de medicina personalizada.
Para isto, organoides de oito indivíduos com as variantes p.Gly85Glu/p.Gly85Glu,
p.Ala561Glu/p.Ala561Glu I, p.Ala561Glu/p.Ala561Glu II, c.3140-26A>G/p.Tyr1014ThrfsTer9,
c.3140-26A>G/p.Gln1100Pro, p.Gln1100Pro/p.Ser4Ter, p.Tyr1092Ter/p.Tyr1092Ter e
p.Gly542Ter/p.Gln220Ter foram analisados. Os resultados dos ensaios FIS demonstraram que a
função da CFTR foi recuperada em seis dos organoides (p.Gly85Glu/p.Gly85Glu,
p.Ala561Glu/p.Ala561Glu I, p.Ala561Glu/p.Ala561Glu II, c.3140-26A>G/p.Tyr1014ThrfsTer9,
c.3140-26A>G/p.Gln1100Pro e p.Gln1100Pro/p.Ser4Ter) enquanto que dois dos organoides
(p.Tyr1092Ter/p.Tyr1092Ter e p.Gly542Ter/p.Gln220Ter) não apresentaram resposta significativa aos
moduladores testados. Assim, conseguimos prever que estes seis indivíduos portugueses poderão obter
benefício clínico dos moduladores aprovados atualmente, o que irá certamente melhorar
significativamente a sua qualidade de vida. Em suma, os resultados obtidos confirmam a utilização da quantificação da CFTR funcional em organoides intestinais 3D para a previsão da eficácia destes
moduladores, numa abordagem personalizada.
Cystic fibrosis (CF) is a life-threatening disease caused by variants in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) gene. This gene encodes a transmembrane protein that is involved in the regulation of chloride (Cl- ) and bicarbonate (HCO3 ‐ ) transport across the plasma membrane of epithelial cells. CFTR variants are grouped into seven functional classes based on their molecular/cellular defect. Recently, small-molecule drugs have been approved for the treatment of people with CF (pwCF) carrying specific CFTR variants. These include VX-770, or ivacaftor (Kalydeco®), a CFTR potentiator that can be combined with VX-661 (tezacaftor), known as Symkevi® (or Symdeko®). The more recent approved triple combination, Kaftrio® (or Trikafta®) consists of ivacaftor and the two correctors tezacaftor and elexacaftor (VX-445). The goal of this MSc project was to help bring personalised therapies to portuguese pwCF carrying rare CFTR variants that are not eligible to receive the currently approved modulator treatments. For this, the Forskolin Induced Swelling (FIS) assay was used to assess the CFTR function in 3D intestinal organoids from those pwCF and to further evaluate the effect of the currently approved CFTR treatments to find the best therapy for each individual. Organoids from eight individuals carrying the following variants: p.Gly85Glu/p.Gly85Glu, p.Ala561Glu/p.Ala561Glu I, p.Ala561Glu/p.Ala561Glu II, c.3140-26A>G/p.Tyr1014ThrfsTer9, c.3140-26A>G/p.Gln1100Pro, p.Gln1100Pro/p.Ser4Ter, p.Tyr1092Ter/p.Tyr1092Ter and p.Gly542Ter/p.Gln220Ter, were analysed. The results of the FIS assays show that CFTR function was rescued in six of the organoids (p.Gly85Glu/p.Gly85Glu, p.Ala561Glu/p.Ala561Glu I, p.Ala561Glu/p.Ala561Glu II, c.3140-26A>G/p.Tyr1014ThrfsTer9, c.3140-26A>G/p.Gln1100Pro and p.Gln1100Pro/p.Ser4Ter), while two (p.Tyr1092Ter/p.Tyr1092Ter and p.Gly542Ter/p.Gln220Ter) did not present any significant responses. Thus, these six portuguese individuals may potentially have clinical benefit from the currently approved CFTR modulators, which can improve their quality of life. In summary, the results obtained here confirm the use of functional CFTR assessment in 3D intestinal organoids to predict the efficacy of these modulators in a personalised approach.
Cystic fibrosis (CF) is a life-threatening disease caused by variants in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) gene. This gene encodes a transmembrane protein that is involved in the regulation of chloride (Cl- ) and bicarbonate (HCO3 ‐ ) transport across the plasma membrane of epithelial cells. CFTR variants are grouped into seven functional classes based on their molecular/cellular defect. Recently, small-molecule drugs have been approved for the treatment of people with CF (pwCF) carrying specific CFTR variants. These include VX-770, or ivacaftor (Kalydeco®), a CFTR potentiator that can be combined with VX-661 (tezacaftor), known as Symkevi® (or Symdeko®). The more recent approved triple combination, Kaftrio® (or Trikafta®) consists of ivacaftor and the two correctors tezacaftor and elexacaftor (VX-445). The goal of this MSc project was to help bring personalised therapies to portuguese pwCF carrying rare CFTR variants that are not eligible to receive the currently approved modulator treatments. For this, the Forskolin Induced Swelling (FIS) assay was used to assess the CFTR function in 3D intestinal organoids from those pwCF and to further evaluate the effect of the currently approved CFTR treatments to find the best therapy for each individual. Organoids from eight individuals carrying the following variants: p.Gly85Glu/p.Gly85Glu, p.Ala561Glu/p.Ala561Glu I, p.Ala561Glu/p.Ala561Glu II, c.3140-26A>G/p.Tyr1014ThrfsTer9, c.3140-26A>G/p.Gln1100Pro, p.Gln1100Pro/p.Ser4Ter, p.Tyr1092Ter/p.Tyr1092Ter and p.Gly542Ter/p.Gln220Ter, were analysed. The results of the FIS assays show that CFTR function was rescued in six of the organoids (p.Gly85Glu/p.Gly85Glu, p.Ala561Glu/p.Ala561Glu I, p.Ala561Glu/p.Ala561Glu II, c.3140-26A>G/p.Tyr1014ThrfsTer9, c.3140-26A>G/p.Gln1100Pro and p.Gln1100Pro/p.Ser4Ter), while two (p.Tyr1092Ter/p.Tyr1092Ter and p.Gly542Ter/p.Gln220Ter) did not present any significant responses. Thus, these six portuguese individuals may potentially have clinical benefit from the currently approved CFTR modulators, which can improve their quality of life. In summary, the results obtained here confirm the use of functional CFTR assessment in 3D intestinal organoids to predict the efficacy of these modulators in a personalised approach.
Descrição
Tese de Mestrado, Biologia Molecular e Genética, 2024, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências
Palavras-chave
Fibrose Quística CFTR Moduladores da CFTR FIS Organoides Intestinais