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Role for histone eviction in macrophage activation
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Autores
Orientador(es)
Resumo(s)
A sepsis é uma condição clínica complexa e potencialmente letal, resultante de uma resposta
desregulada do hospedeiro a uma infeção. A sepsis inicia-se frequentemente com uma infeção
localizada, que pode ser bacteriana, viral, fúngica ou parasitária. No entanto, o que distingue a sepsis de
outras infeções é a forma como o sistema imunitário reage a estes invasores. Em vez de se localizar e
eliminar a fonte da infeção, a resposta inflamatória torna-se exagerada e generalizada, afetando tecidos
e órgãos saudáveis. Esta resposta exagerada é muitas vezes acompanhada pela libertação excessiva de
mediadores inflamatórios no sangue, incluindo citocinas, quimiocinas e fatores de coagulação, estes
fatores pro-inflamatórios em quantidades exageradas levam a danos tecidulares e falência de órgãos.
Esta doença tem uma taxa de mortalidade muito elevada e ainda não existe uma cura que seja capaz de
tratar este problema. Assim, este trabalho tem como finalidade fazer parte de uma estratégia que envolve
outros projetos no laboratório, em que se procura encontrar uma nova abordagem para o tratamento
desta condição médica.
Os macrófagos são células especializadas do sistema imunitário inato, a sua principal função é
detetar, apresentar antigénios, fagocitar e destruir patógenos, como bactérias e vírus. No entanto, a sua
atuação não se limita apenas à defesa direta do organismo contra agentes patogénicos, estas células
também desempenham um papel vital na modulação da resposta imunitária, produzindo e libertando
uma variedade de citocinas e quimiocinas que vão ativar outras células do sistema imunitário.
As antraciclinas representam uma classe de antibióticos anti-tumorais, cujo mecanismo de ação se
baseia na intercalação com o DNA e na inibição da Topoisomerase II, uma enzima vital para a replicação
do DNA. Este processo interfere no ciclo celular, impedindo a replicação e, consequentemente, a divisão
celular. A Epirrubicina, uma análoga da Doxorrubicina, é uma das antraciclinas mais utilizadas em
regimes de quimioterapia. Esta apresenta um espectro de atividade anti-tumoral semelhante ao da
Doxorrubicina, mas com uma toxicidade cardíaca ligeiramente mais baixa, podendo haver aumento da
dosagem e por isso ser mais eficaz nos tratamentos. A Epirrubicina, também pode induzir a formação
de radicais livres que acabam por causar danos no DNA e nas membranas celulares, contribuindo para
o seu efeito citotóxico.
Num estudo anteriormente realizado, a equipa do laboratório no IGC demostrou que as antraciclinas
induzem tolerância à doença face a infeções in vivo. Em modelos de ratinhos com sepsis, doses baixas
de antraciclinas, como a Epirrubicina, levaram a uma doença menos agressiva e a uma mortalidade
reduzida, independentemente da carga patogénica após a infeção. Este estudo também descobriu que o
ATM (Ataxia Telangiectasia Mutada), um “sensor” de dano no DNA, é necessário para a tolerância à
doença mediada pela Epirrubicina. Além dos papéis nas respostas aos danos no DNA (DDRs), o ATM
participa numa complexa rede de vias de sinalização que se ligam com o NF-κB.
Uma descoberta importante em ratinhos com sepsis, tratados com Epirrubicina, e que também foi
observada em linhas celulares THP-1 induzidas com estímulos pró-inflamatórios como o LPS, foi a forte
supressão da secreção de citocinas, incluindo o TNF. Estes mecanismos de doses baixas de antraciclinas
regulam negativamente a transcrição de genes pró-inflamatórios em macrófagos primários de ratinhos,
e os danos no DNA causado pelas antraciclinas é o mecanismo para a regulação negativa da transcrição
de citocinas e outros mediadores pró-inflamatórios. Neste estudo, foram observadas interações diretas
entre a Epirrubicina e fatores associados à cromatina, como subunidades do fator de transcrição próinflamatório NF-κB. Devido a estas novas descobertas relacionadas com o mecanismo de ação das
antraciclinas na regulação da inflamação, é possível que esta classe de drogas possa contribuir para uma
proteção em pacientes com sepsis.
As histonas são proteínas nucleares fundamentais responsáveis pelo empacotamento do DNA em
estruturas denominadas nucleossomas. Cada nucleossoma é composto por um octâmetro de histonas, contendo duas cópias de cada uma das histonas principais: H2A, H2B, H3 e H4, em torno do qual está
enrolada uma sequência de DNA. A modulação da estrutura das histonas, através de modificações póstradicionais, como acetilação, metilação, fosforilação e ubiquitinação, desempenha um papel importante
na regulação da expressão genética. Estas modificações podem alterar a acessibilidade do DNA à
maquinaria de transcrição, facilitando ou reprimindo a expressão de genes específicos. No contexto da
resposta imunitária, a remodelação da cromatina mediada por histonas é fundamental para a rápida e
eficaz ativação ou supressão de genes em resposta a estímulos inflamatórios. Dada a importância das
histonas na regulação genética, a possibilidade de compostos como a Epirrubicina poderem influenciar
a dinâmica das histonas oferece uma nova dimensão na compreensão das interações entre agentes
farmacológicos e respostas pró-inflamatórias.
Para investigações em laboratório, as células THP-1 surgem como uma ferramenta valiosa. Estas
células, derivadas de uma leucemia humana, podem ser induzidas a comportarem-se como macrófagos,
permitindo estudos detalhados sobre a função e a resposta dos macrófagos a diferentes estímulos
inflamatórios.
Em termos de técnicas de avaliação, o ELISA é um método bioquímico que permite detetar e
quantificar substâncias específicas, como proteínas enquanto o qRT-PCR é uma ferramenta molecular
que permite analisar a expressão de genes através da quantificação d moléculas de mRNA através da
deteção de cDNA com o uso de primers específicos.
O objetivo principal deste trabalho foi investigar o papel das antraciclinas (apenas usada a
Epirrubicina) na regulação das histonas em macrófagos durante uma resposta inflamatória. Para isso
foram usadas células de linhagens celulares (THP-1) e macrófagos de ratinhos, estas células sofreram
tratamentos com diferentes concentrações de Epirrubicina (0.5µM, 1µM, 2µM) e estimuladas com LPS
e outros TLR agonistas. Foram usados controlos sem tratamento com Epi e sem estímulos infeciosos, e
outras células com apenas estímulos infeciosos. Na técnica de ELISA foram quantificados os níveis de
TNF-α produzidos pelas células, tendo obtido valores concordantes com estudos anteriores; o LPS e
outros agonistas levaram à produção de citocinas como o TNF-α e Il-1β em quantidades superiores a
100x os controlos, o que comprova uma forte resposta a estímulos inflamatórios por estas células do
sistema imunitário. O qRT-PCR foi usado para quantificar mRNAs de nove genes de histonas.
Durante a análise dos resultados, observou-se que as células tratadas com Epirrubicina não
demonstraram níveis significativos de expressão de histonas, e alguns resultados até demonstraram uma
redução na regulação destas proteínas o que pôs em causa a hipótese originalmente colocada para este
trabalho. Um aspeto interessante encontrado durante estas experiências, foi que as células estimuladas
com estímulos inflamatórios como o LPS, levaram a uma regulação negativa de histonas o que levanta
a hipótese destes estímulos infeciosos provocarem uma desregulação na produção de histonas. Uma
histona particularmente interessante relativamente à regulação negativa por parte do LPS foi a
Hist2h2be, esta proteína teve uma clara regulação negativa quando as células foram estimuladas com
este estímulo inflamatório. Devido a estes resultados, esta histona poderá vir a ser estudada em projetos
posteriores neste laboratório. Algumas teorias relativamente a estas descobertas apontam para que,
devido às histonas conferirem uma compactação da cromatina e dificultarem a transcrição de genes, a
remoção destas proteínas e a sua regulação negativa, pode ser importante para a produção de citocinas
e outras moléculas fundamentais na resposta inflamatória das células, a sua fraca regulação também
pode ser devido à prioridade dada pelas células à produção de substâncias pro-inflamatórias em vez da
transcrição de genes de histonas. No entanto estas teorias apenas foram colocadas para tentar responder
aos desafios encontrados durante este trabalho, para confirmar estas hipóteses serão necessários mais
estudos, com parâmetros mais detalhados, para se poder verificar e provar estas teorias.
Sepsis is life-threatening extreme immune response to an infection, this can often lead to tissue damage, organ failure and death. Despite the advances in modern medicine, sepsis remains a very challenging medical condition. This work aimed to be part of the efforts of the host laboratory to find a therapeutic strategy against sepsis. Macrophages are major players in the immune response, these cells undergo significant transcriptional changes during infection and inflammation, one of these modifications could be the structural proteins in chromatin called histones. The role of histones, especially in terms of their gene expression regulation, remains an area of profound interest given their potential to influence macrophage activation. This study aimed to investigate the role of anthracyclines (Epirubicin) in the histone regulation in macrophages during inflammatory responses. The initial hypothesis was that histone gene expression could be regulated by Epirubicin during an infection. To test this theory, it was conducted a serious of experiments, in THP-1 cells and primary mice macrophages with infection stimuli such as LPS and other TLRagonistsfollowing Epirubicin treatment. Using advanced experimental techniques, includingELISA and qRT-PCR, it was measured the regulation of mRNA and protein levels of pro-inflammatorycytokines such as TNF-α and Il-1β, and eight specific histone genes in both THP-1 cells and primary mouse macrophages. Contrary to initial theories, Epirubicin did not show to be a histone up-regulator agent in macrophages, however, an interesting finding was that LPS appeared to be a potential down-regulator of histone expression, especially concerning the histone variant Hist2h2be. This observation highlights the potential complexities linking inflammatory stimuli to histone regulation. Future perspectives could include a more profound study of histone genes expression during inflammation, by selecting further histone genes, test different infection stimulus and potentially using in vivo models and human samples.
Sepsis is life-threatening extreme immune response to an infection, this can often lead to tissue damage, organ failure and death. Despite the advances in modern medicine, sepsis remains a very challenging medical condition. This work aimed to be part of the efforts of the host laboratory to find a therapeutic strategy against sepsis. Macrophages are major players in the immune response, these cells undergo significant transcriptional changes during infection and inflammation, one of these modifications could be the structural proteins in chromatin called histones. The role of histones, especially in terms of their gene expression regulation, remains an area of profound interest given their potential to influence macrophage activation. This study aimed to investigate the role of anthracyclines (Epirubicin) in the histone regulation in macrophages during inflammatory responses. The initial hypothesis was that histone gene expression could be regulated by Epirubicin during an infection. To test this theory, it was conducted a serious of experiments, in THP-1 cells and primary mice macrophages with infection stimuli such as LPS and other TLRagonistsfollowing Epirubicin treatment. Using advanced experimental techniques, includingELISA and qRT-PCR, it was measured the regulation of mRNA and protein levels of pro-inflammatorycytokines such as TNF-α and Il-1β, and eight specific histone genes in both THP-1 cells and primary mouse macrophages. Contrary to initial theories, Epirubicin did not show to be a histone up-regulator agent in macrophages, however, an interesting finding was that LPS appeared to be a potential down-regulator of histone expression, especially concerning the histone variant Hist2h2be. This observation highlights the potential complexities linking inflammatory stimuli to histone regulation. Future perspectives could include a more profound study of histone genes expression during inflammation, by selecting further histone genes, test different infection stimulus and potentially using in vivo models and human samples.
Descrição
Tese de Mestrado, Bioquímica e Biomedicina, 2024, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciência
Palavras-chave
Sepsis Macrófagos Histonas LPS Epirrubicina Teses de mestrado - 2024