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Publicação
Multi-functional nanovaccine modulates dendritic cell effector function against melanoma
| Nome: | Descrição: | Tamanho: | Formato: | |
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Autores
Resumo(s)
Objetivo: Apesar dos avanços alcançados na imunoterapia nas últimas décadas, o desenvolvimento de vacinas anti-tumorais, profiláticas ou terapêuticas, seguras e altamente imunogénicas para controlar e erradicar o melanoma continua a ser uma das tarefas mais exigentes e desafiantes. Para impedir a progressão e mestastização deste tumor, as células apresentadoras de antigénio altamente especializadas, como as células dendríticas, induzem respostas imunitárias humorais e celulares eficazes. Mais especificamente, a indução de anticorpos secretados pelos linfócitos B e a estimulação de linfócitos T citotóxicos, juntamente com uma resposta do tipo Th1, parecem ser cruciais para travar a disseminação deste tumor. Deste modo, o aparecimento do melanoma e a resistência a determinadas terapias parece estar intimamente associada à inadequada estimulação de uma resposta imunológica eficaz e específica capaz de destruir o tumor. As células dendríticas são atualmente reconhecidas como entidades fundamentais para a estimulação de uma resposta imunológica robusta e específica contra o melanoma, a qual se deve à sua capacidade de migração para os órgãos linfáticos, zonas ricas em linfócitos T, onde apresentarão os antigénios fagocitados e, consequentemente, levarão à estimulação dos linfócitos T CD4+ e CD8+, promovendo um eficiente e prolongado controlo do tumor. Esta nanovacina pretende induzir memória imunológica, controlando assim reincidências do tumor, sem a necessidade de tratamentos contínuos, contrariamente aos anticorpos monoclonais e a terapias com base nas células T. Contudo, o desenvolvimento de vacinas e de abordagens imunoterapêuticas contra o melanoma tem sido bastante dificultado pela complexidade dos mecanismos imunológicos associados. Deste modo, torna-se desejável o desenvolvimento de novas estratégias capazes de modelar a resposta imunológica contra o melanoma. Neste seguimento, as nanopartículas poliméricas constituem sistemas promissores para o transporte de antigénios de melanoma, potenciadores da resposta imune e outras moléculas com atividade biológica. De fato, estes nanosistemas protegem os antigénios de melanoma das condições desfavoráveis após a sua administração e podem atuar como imuno-adjuvantes, aumentando o reconhecimento e a internalização de antigénios pelas células dendríticas. Assim, este projeto tem como objetivo criar uma nanovacina contra o melanoma através da encapsulação dos péptidos antigénicos OVA MHCI e MHCII em nanopartículas poliméricas, assim como de agentes que potenciem ainda mais o efeito imuno-adjuvante desta nanopartícula, como o CpG e o poly(I:C). Além disso, também incorporámos na nanopartícula um gene regulador de um checkpoint imunológico, de forma a inibir os mecanismos de imunossupressão mediados por este gene. Deste modo, investigámos em ratinhos imuno-competentes se, inibindo a expressão deste gene, resultaria numa maior eficácia anti-tumoral, em comparação com a administração da nanovacina apenas com os antigénios e adjuvantes. Materiais e Métodos: As nanopartículas poliméricas foram preparadas utilizando o método de dupla emulsão com a evaporação do solvente. Os polímeros usados foram poli(ácido láctico-co-glicólico) PLGA, poli(ácido láctico) PLA e PLGA-polietileno glicol (PLGA-PEG). Os tensioativos álcool polivinílico (PVA), pluronicoF127 e sucinato de tocoferol polietileno glicol (TPGS) foram incluídos na formulação da vacina para promover o seu potencial efeito imuno-adjuvante e/ou aumentar a estabilidade das nanopartículas. A caracterização da nanopartícula foi realizada tendo em conta o seu diâmetro, carga à superfície e morfologia por Dispersão Dinâmica de Luz, Dispersão Electroforética da Luz e Microscopia de Força Atómica, respetivamente. A estabilidade da nanopartícula, armazenada a 4 e a 37 ºC, foi monitorizada uma vez por semana, durante 5 semanas, em relação ao diâmetro, distribuição do tamanho e carga superficial. Os antigénios OVA MHCI e MHCII foram incorporados na nanopartícula, assim como os imuno-adjuvantes CpG e poly(I:C). O regulador génico foi incorporado, adicionalmente, nas nanovacinas para o efeito. A eficiência de incorporação (EE, % (w/w)) e capacidade de carga (LC, μg/mg) dos agentes imuno-terapêuticos incorporados foram quantificados pelo ensaio de fluorescamina, oligreen e picogreen, respetivamente. As células dendríticas foram usadas para avaliar a citotoxicidade in vitro das nanopartículas através da actividade mitocondrial (ensaio MTT) e integridade da membrana celular (citometria de fluxo usando iodeto de propidio), às 24 e 48 horas. A internalização das nanopartículas marcadas com cy5 foi avaliada por citometria de fluxo em diferentes tempos (3, 6, 17, 24 e 48 horas). Por fim, explorámos a regressão do melanoma in vivo, recorrendo a um modelo de ratinhos imuno-competentes, após administração dos antigénios e adjuvantes numa solução livre, da nanovacina sozinha, ou da nanovacina com o gene regulador do checkpoint imunológico encapsulado, aumentando o conhecimento entre a biologia e a imunologia do melanoma. Resultados: As nanopartículas apresentaram um diâmetro hidrodinâmico médio de 180 nm, com uma distribuição de tamanhos restrita (PdI < 0.15) e carga superficial próxima da neutralidade. Tendo em consideração os resultados previamente descritos, nomeadamente as características físico-químicas das nanopartículas, a melhor formulação foi selecionada para os estudos seguintes. A nanopartícula selecionada apresentou forma esférica e estabilidade das suas propriedades, quando armazenadas a 4 e a 37 ºC, durante 5 semanas. Antes de iniciar os estudos in vivo, verificámos previamente que nenhum efeito citotóxico foi observado nas concentrações testadas de 0.25 e 0.50 mg/ml, após 48 horas de incubação das nanopartículas com as células dendríticas JAWSII. Além disso, a citometria de fluxo confirmou a internalização das nanopartículas por estas células. As nanovacinas desenvolvidas para a imunização dos animais apresentaram elevada eficiência de incorporação (EE, % (w/w)) e capacidade de carga (LC, μg/mg) das moléculas bioactivas encapsuladas. Por fim, a imunização dos animais, previamente induzidos com o tumor, com a nano-vacina com o gene regulador encapsulado resultou numa inibição máxima do crescimento tumoral. Por outro lado, ratinhos com melanoma tratados com os antigénios e os adjuvantes livres em solução, não apresentaram uma resposta anti-tumoral superior à induzida pelo tratamento com as nanovacinas. Conclusões: Os resultados aqui descritos mostram que nanopartículas estáveis e reprodutíveis foram desenvolvidas utilizando o método de dupla emulsão com evaporação de solvente. Importa, no entanto, realçar que as nanovacinas desenvolvidas neste projeto constituem uma plataforma promissora para o transporte e eficaz apresentação de antigénios do tumor, tendo em vista o desenvolvimento de uma vacina eficaz contra o melanoma. Neste trabalho é reportado o desenvolvimento de nanopartículas poliméricas biodegradáveis e biocompatíveis, assim como, de nano-vacinas contra o melanoma e a modulação de um checkpoint imunológico, para ultrapassar as limitações apresentadas na clínica aquando da utilização de agentes imunoterapêuticos para a modulação deste mecanismo de imunosupressão. A utilização de nanopartículas permite a entrega de antigénios tumorais e potenciadores da resposta imunitária diretamente às células apresentadoras de antigénios, o que potenciará a indução de uma resposta imunitária anti-tumoral e indução de memória imunológica. Embora esta resposta seja restringida, em último caso, por mecanismos de imunossupressão desenvolvidos pelo próprio tumor, demonstrou-se que a combinação das nano-vacinas com a terapia de checkpoint imunológico permite uma potenciação da resposta imunitária anti-tumoral, com aumento da sobrevivência e inibição do crescimento do tumor. Este resultado constitui um importante avanço nesta área, abrindo novos caminhos para o desenvolvimento de abordagens terapêuticas alternativas. As nanopartículas, com papel de nano-vacinas, serão certamente fundamentais na elaboração de estratégias inovadoras que permitirão o avanço do tratamento do cancro. Além disso, a administração de nanovacinas por diferentes vias de administração, como a via mucosa, extremamente permeável e não invasiva, emerge como uma alternativa promissora mas que requer estudos adicionais para provar a sua utilidade vantajosa, face a outras vias bastante conhecidas e estudadas, no tratamento do melanoma.
Purpose: Despite the improvements achieved in the current cancer therapy regimens, the development of therapeutic, safe and highly immunogenic vaccines to control and eradicate melanoma tumor remains one of the most exigent and challenging tasks. Although immune checkpoint therapy improved the clinical outcomes of melanoma treatment, low response rate, severe side effects and acquired resistance have been observed in clinical practice. In order to overcome these limitations, complementary strategies that inhibit tumor immunosuppressive pathways and enhance immunity are urgently needed. As a promising strategy for vaccine delivery systems, polymeric nanoparticles (NP) are able to protect antigens from unfavorable conditions after administration, in addition of acting as adjuvants by enhancing the antigen recognition and uptake by dendritic cells (DC). Therefore, a rationally-designed nanomedicine was developed to target DC, aiming at the induction of effective and broad humoral and cellular immune responses. Additionally, we entrapped a gene regulator of a tumor-related immune evasion player within a multifunctional NP to modulate its expression by melanoma cells, and thereby overcome the local immunosuppression established during tumor development. The impact of these nanovaccines and the effect of their combination with a gene regulator were investigated in an immune-competent melanoma mouse model. Materials and Methods: For this purpose, we designed, synthesized and characterized mannose-grafted and PEGylated poly(lactic acid) (PLA) nanovaccines, entrapping tumor peptides and immune potentiators. Polyvinyl alcohol (PVA), d-α-tocopheryl PEG 1000 succinate (TPGS) and other surfactants and/or immune adjuvants were included in the vaccine formulation to promote their potential adjuvant effect and improve NP stability. Model antigen ovalbumin (OVA), Major histocompatibility complex type I (MHCI) and MHCII melanoma-associated peptides, as well as the toll-like receptor (TLR) ligands CpG and Poly(I:C), and gene regulators of immune-related evasion markers were entrapped in these NP. Nanovaccine physicochemical properties were fully addressed and their internalization and impact on DC viability were assessed in vitro. Characterization of NP was performed in terms of size distribution, zeta potential and surface morphology by Dynamic Light Scattering (DLS), Laser Doppler Electrophoresis (LDE) and Atomic Force Microscopy (AFM), respectively. Entrapment efficiency (EE) and loading capacity (LC) of the entrapped bioactive molecules were determined. DC were used to evaluate in vitro the impact of NP by MTT and Propidium Iodide (PI), as well as the cellular uptake of NP by FACS. Finally, we evaluated in vivo the anti-melanoma efficacy of this novel polymeric-based multi-functional immunotherapeutic nanodelivery system, expanding the knowledge between melanoma biology and immunology. Results: NP presented an average diameter of 180 nm, with a narrow size distribution (PdI < 0.15), near-neutral surface charge and spherical shape. The best NP formulation was selected for further studies based on its physicochemical characteristics. Selected NP demonstrated no toxic effect on DC at a concentration up to 0.50 mg/ml, after 48 hours of incubation. Flow cytometry confirmed the extensive internalization of these multi-functional NP. This antigen delivery system presented high EE and LC, and great stability over 5 weeks. Nanovaccine entrapping the melanoma-associated antigens and the TLR ligands combined with the regulator of the expression of the tumor immunosuppressive target under evaluation induced a strong immune response able to control tumor growth over 39 days. Conclusions: The results herein described show that a stable and reproducible nanovaccine formulation was developed, constituting a promising platform for the successful delivery of melanoma antigens to DC, in combination with immune potentiators, modulating the anti-tumor immune-mediated effect induced in a murine melanoma model. Our findings reveal important aspects regarding the targeting of immune checkpoints using multi-functional polymeric cancer nanovaccines. Overall, this multi-functional nanovaccine emerges as a potential strategy to improve the clinical outcomes of melanoma treatment.
Purpose: Despite the improvements achieved in the current cancer therapy regimens, the development of therapeutic, safe and highly immunogenic vaccines to control and eradicate melanoma tumor remains one of the most exigent and challenging tasks. Although immune checkpoint therapy improved the clinical outcomes of melanoma treatment, low response rate, severe side effects and acquired resistance have been observed in clinical practice. In order to overcome these limitations, complementary strategies that inhibit tumor immunosuppressive pathways and enhance immunity are urgently needed. As a promising strategy for vaccine delivery systems, polymeric nanoparticles (NP) are able to protect antigens from unfavorable conditions after administration, in addition of acting as adjuvants by enhancing the antigen recognition and uptake by dendritic cells (DC). Therefore, a rationally-designed nanomedicine was developed to target DC, aiming at the induction of effective and broad humoral and cellular immune responses. Additionally, we entrapped a gene regulator of a tumor-related immune evasion player within a multifunctional NP to modulate its expression by melanoma cells, and thereby overcome the local immunosuppression established during tumor development. The impact of these nanovaccines and the effect of their combination with a gene regulator were investigated in an immune-competent melanoma mouse model. Materials and Methods: For this purpose, we designed, synthesized and characterized mannose-grafted and PEGylated poly(lactic acid) (PLA) nanovaccines, entrapping tumor peptides and immune potentiators. Polyvinyl alcohol (PVA), d-α-tocopheryl PEG 1000 succinate (TPGS) and other surfactants and/or immune adjuvants were included in the vaccine formulation to promote their potential adjuvant effect and improve NP stability. Model antigen ovalbumin (OVA), Major histocompatibility complex type I (MHCI) and MHCII melanoma-associated peptides, as well as the toll-like receptor (TLR) ligands CpG and Poly(I:C), and gene regulators of immune-related evasion markers were entrapped in these NP. Nanovaccine physicochemical properties were fully addressed and their internalization and impact on DC viability were assessed in vitro. Characterization of NP was performed in terms of size distribution, zeta potential and surface morphology by Dynamic Light Scattering (DLS), Laser Doppler Electrophoresis (LDE) and Atomic Force Microscopy (AFM), respectively. Entrapment efficiency (EE) and loading capacity (LC) of the entrapped bioactive molecules were determined. DC were used to evaluate in vitro the impact of NP by MTT and Propidium Iodide (PI), as well as the cellular uptake of NP by FACS. Finally, we evaluated in vivo the anti-melanoma efficacy of this novel polymeric-based multi-functional immunotherapeutic nanodelivery system, expanding the knowledge between melanoma biology and immunology. Results: NP presented an average diameter of 180 nm, with a narrow size distribution (PdI < 0.15), near-neutral surface charge and spherical shape. The best NP formulation was selected for further studies based on its physicochemical characteristics. Selected NP demonstrated no toxic effect on DC at a concentration up to 0.50 mg/ml, after 48 hours of incubation. Flow cytometry confirmed the extensive internalization of these multi-functional NP. This antigen delivery system presented high EE and LC, and great stability over 5 weeks. Nanovaccine entrapping the melanoma-associated antigens and the TLR ligands combined with the regulator of the expression of the tumor immunosuppressive target under evaluation induced a strong immune response able to control tumor growth over 39 days. Conclusions: The results herein described show that a stable and reproducible nanovaccine formulation was developed, constituting a promising platform for the successful delivery of melanoma antigens to DC, in combination with immune potentiators, modulating the anti-tumor immune-mediated effect induced in a murine melanoma model. Our findings reveal important aspects regarding the targeting of immune checkpoints using multi-functional polymeric cancer nanovaccines. Overall, this multi-functional nanovaccine emerges as a potential strategy to improve the clinical outcomes of melanoma treatment.
Descrição
Tese de mestrado, Ciências Biofarmacêuticas, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2019
Palavras-chave
Nanovaccine Immune evasion Gene regulator Routes of administration Melanoma Teses de mestrado - 2019