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Publicação
Exploring medical grade silicone functionalization with sophorolipids towards antibiofilm properties improvement
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Autores
Resumo(s)
O uso de dispositivos médicos, como cateteres, tubos endotraqueais, implantes e pacemakers, pode levar a infeções devido à presença de flora bacteriana na pele humana antes da inserção do dispositivo médico e também devido à contaminação do material ou do ambiente hospitalar. As infeções mais frequentemente relatadas são infeções associadas a cateteres colocados diretamente na corrente sanguínea e no trato urinário, e pneumonias associadas ao uso de ventiladores, associadas à formação de biofilmes. Um dos microrganismos mais frequentemente observados nos episódios de infeções na corrente sanguínea, é a bactéria Staphylococcus aureus, que se pode adaptar facilmente ao hospedeiro humano e ao ambiente das instalações hospitalares e provocar infeções graves e fatais. A comunidade científica tem vindo a desenvolver várias abordagens alternativas contra a formação de biofilmes, no entanto o uso de revestimentos com antibióticos, podem desencadear resistência antimicrobiana, limitando as opções para tratamento das infeções. O uso de alguns compostos extraídos de plantas ou microorganismos tem vindo a demonstrar boa atividade contra a formação de biofilme nos últimos anos de investigação. Os compostos produzidos por microorganismos que são ativos em superfícies têm atraído muita atenção nos últimos anos, uma vez que são uma alternativa promissora aos tensioactivos sintetizados quimicamente. Estes compostos podem ser divididos nos de baixo peso molecular (biotensioactivos) e de elevado peso molecular (bioemulsificantes). Os biotensioactivos são biodegradáveis e apresentam baixa toxicidade. Dado que existem vários tipos de biotensioactivos, e considerando a necessidade de desenvolver biotensioactivos mais sustentáveis, os glicolípidos são compostos promissores devido à sua capacidade de serem produzidos a partir de recursos naturais renováveis, mais precisamente nas membranas celulares de bactérias, fungos, plantas e animais. Estes glicolípidos são capazes de modificar a hidrofobicidade da superfície celular, podendo ser utilizados para interromper a formação de biofilme e inibir a adesão de bactérias patogénicas. Um dos grupos de glicolípidos mais estudados são os soforolípidos (SLs), que são produzidos principalmente por estirpes de leveduras como Starmerella bombicola, Candida bombicola, Caloptilia magnoliae e Rhodotorula Bogoriensis, utilizando substratos lipofílicos e carbohidratos. Estes compostos são produzidos em duas formas estruturais principais, acídicas e lactónicas, e podem apresentar grupos acetilo no seu grupo soforose, o que leva a diferentes propriedades físico-químicas e biológicas. Quando adsorvidos a uma superfície, têm demonstrado capacidade de modificar a hidrofobicidade da superfície, alterando a adesão bacteriana e consequentemente a formação de biofilme. O presente trabalho tem como objetivo a síntese, caracterização, purificação de diferentes SLs e a funcionalização da superfície de silicone de grau médico funcionalizado com os compostos mais ativos, a fim de avaliar as propriedades antimicrobianas do biomaterial. Neste contexto, os soforolípidos foram biossintetizados pela levedura Starmerella bombicola num meio de cultura com extrato de levedura com glucose e peptona, suplementado com óleo de borragem ou ácido oleico. As misturas obtidas foram analisadas por cromatografia liquida de ultra eficiência acoplada a espectrometria de massa (CLUE-EM) e submetidas a purificação e isolamento. Para tal, foram utilizados dois métodos: cromatografia flash de fase reversa e extração de fase sólida, utilizando como fase móvel um gradiente acetonitrilo: água. Para o acompanhamento da purificação dos compostos obtidos, foi utilizado um método de cromatografia em camada fina (CCF) e CLUE-EM. Para evitar o uso de clorofórmio da fase móvel convencional da CCF, foi realizada uma otimização deste método, substituindo assim o clorofórmio por diclorometano. De forma a obter um SL acídico isolado a partir da mistura, foi também realizada uma reação de hidrólise alcalina. A identificação dos compostos isolados foi efetuada por CLUE-EM e ressonância magnética nuclear (RMN). A atividade antimicrobiana de todos os compostos obtidos foi avaliada pela determinação da concentração inibitória mínima (CIM) capaz de inibir a bactéria Staphylococcus aureus ATCC 25923. Os compostos mais ativos foram funcionalizados à superfície do silicone por adsorção. O composto acídico isolado e a mistura inicial de SLs foram funcionalizados à superfície, utilizando o método de funcionalização química, por oxidação química seguindo-se a reação com carbodiimida. A funcionalização destes compostos à superfície do silicone foi confirmada por espetroscopia de infra-vermelho com transformada de Fourier (EIVTF) e por medição de ângulos de contacto tendo de seguida sido foi avaliada a atividade antibiofilme (i.e. ensaio de cristal-violeta e contagem de unidades formadoras de colónias) contra a bactéria Staphylococcus aureus ATCC 25923 e também realizado ensaios de biocompatibilidade face a uma linha celular de querotinócitos humanos imortalizados, HaCaT. Foi possível obter duas misturas de SLs distintas quando o meio de produção foi suplementado com óleo de borragem e ácido oleico. Utilizando um método inicial de cromatografia flash em fase reversa (começando com uma percentagem de 20% e 80% de acetonitrilo e água Millipore, respetivamente, aumentando em 5% a percentagem de acetonitrilo a cada 5 minutos) foi possível isolar os compostos lactónicos C18:0, C18:1, C18:2 e C18:3 diacetilados, aquando da suplementação com óleo de borragem. Após otimização do método (iniciando a separação com 70% e 30% de acetonitrilo e água Millipore, respetivamente), foram isolados, a partir das misturas de SLs obtidas utilizando como fonte lipídica ácido oleico ou óleo de borragem, os compostos lactónicos C18:0 e C18:1 diacetilados. Estes dois compostos foram também isolados utilizando um método otimizado de extração de fase sólida, com um gradiente acetonitrilo: água. A mistura inicial de SLs foi ainda submetida a uma reação de hidrólise alcalina, obtendo o SL acídico C18:1 não acetilado, que foi posteriormente utilizado numa reação de carbodiimida, de forma a obter um SL com um grupo amida terminal. Foi possível confirmar as estruturas químicas dos SLs lactónicos diacetilados, do SL acídico C18:1 não acetilado e do SL acídico C18:1 com um grupo amida terminal por CLUE-EM e RMN. Após a avaliação da atividade antimicrobiana de todos os compostos obtidos pela determinação da CIM contra a bactéria Staphylococcus aureus ATCC 25923 foi observado que os compostos com menor grau de insaturação (SLs lactónicos C18:0 e C18:1 diacetilados) e a mistura inicial de SLs apresentaram a melhor atividade antimicrobiana contra este microorganismo (50 μg mL-1). Foi possível confirmar a adsorção dos compostos com melhor atividade (SLs lactónicos C18:0 e C18:1 diacetilados) e uma mistura de SLs lactónicos por EIVTF visualizando-se as bandas 3398 cm-1, 2923 cm-1, 2854 cm-1 e 1745 cm-1 características dos SLs e 2962 cm-1. A medição dos ângulos de contacto ao longo do tempo dos espécimes funcionalizados permitiu verificar um aumento da molhabilidade das superfícies funcionalizadas quando comparadas com silicone não funcionalizado. Os resultados obtidos através do método do cristal violeta mostraram uma inibição de biofilme de 98% para as amostras de silicone revestidas com a mistura de SLs lactónicos e com os SLs lactónicos isolados C18:0 e C18:1, na gama de concentração de 0,10 a 1,50 mg mL-1. Uma redução de 6 log no número de colónias presentes nas amostras revestidas com soforolípidos lactónicos C18:0 e C18:1, e de 5 log no número de colónias em amostras revestidas com a mistura de soforolípidos lactónicos foi também observada. O SL acídico C18:1 não acetilado isolado foi também adsorvido à superfície do silicone e apesar da atividade antimicrobiana não se apresentar promissora foi possível observar um aumento da hidrofilia da superfície por comparação com o silicone não tratado. A funcionalização direta da mistura inicial de SLs e o SL acídico C18:1 não acetilado ao silicone por meio de reações químicas (chemical-etching) foi confirmada por medições de ângulos de contacto e por EIVTF, tendo sido observadas no espetro as mesmas bandas características que no espetro obtido para a funcionalização da superfície por adsorção dos SLs. Foi ainda observada uma banda a 1641 cm-1 que poderá representar o carbonilo do grupo amida após reação com (3-aminopropil)trietoxissilano (APTES). Após a realização dos ensaios antimicrobianos, foi observada uma redução da formação de biofilme de 70% e 40% com a mistura inicial de SLs e o SL acídico C18:1 não acetilado, respetivamente. Ao submeter os espécimes de silicone funcionalizados quer por adsorção quer por funcionalização química a ensaios de biocompatibilidade face a células HaCaT, foi observada apenas uma diminuição de viabilidade para a mistura de SLs lactónicos e para o SL lactónico C18:0 diacetilado, ao usar a concentração mais alta (1,50 mg mL-1). Todos os outros espécimes funcionalizados (com SL lactónico C18:1 diacetilado por adsorção, e a mistura de SLs lactónicos e o SL lactónico C18:0 diacetilado por funcionalização química) não apresentaram efeitos citotóxicos nas células HaCaT , na gama de concentração de 0,10 a 1,50 mg mL-1. Os SLs lactónicos podem representar uma abordagem interessante na prevenção da formação de biofilme em superfícies de dispositivos médicos e infeções relacionadas com estes dispositivos, bem como a conjugação dos SLs com a superfície de silicone através de reações para modificação da superfície.
The use of medical devices such as catheters, endotracheal tubes and pacemakers is certainly lifesaving nevertheless it can lead to medical devices associated infections. The biofilms formed on the devices surface are a challenging subject all over the world, since the use of antibiotics can trigger antimicrobial resistance and few alternatives are available for the infection treatment. The aim of this thesis was to synthesize, characterize, purify different sophorolipids (SLs) and functionalize medical grade silicone surface with the most active compounds in order to evaluate the biomaterial antimicrobial properties. SLs were biosynthesized in a glucose peptone yeast extract seed culture media, supplemented with borage oil or oleic acid, by Starmerella bombicola. The compounds obtained were isolated by flash chromatography or solid phase extraction and characterized by Ultra-performance liquid chromatography coupled to mass spectrometry and Nuclear Magnetic Resonance. Additionally, an alkaline hydrolysis was performed to obtain an acid SL. Silicone surface was functionalized with the SLs by adsorption or chemical-etching and specimens antimicrobial activity was evaluated against the bacteria Staphylococcus aureus ATCC 25923, as well as their biocompatibility towards the HaCaT human cells. Lactonic compounds with different unsaturation degrees (i.e. C18:0, C18:1, C18:2 and C18:3 lactonic diacetylated SLs) were isolated, as well as an acidic SL obtained from the alkaline hydrolysis and a derivative with a terminal amide bond. Compounds with a lower unsaturation degree (i.e. C18:0 and C18:1 lactonic diacetylated SLs) and lactonic SLs mixture presented higher antibiofilm activity against Staphylococcus aureus ATCC 25923 by adsorption, showing approximate 100 % biofilm inhibition and a 6 and 5 log reduction on the number of colonies formed. The conjugation of the acidic SL and the initial SLs mixture by chemical-etching also showed a decrease on the biofilm formation (40% and 70%, respectively). Although the acidic compounds did not reveal so great results as the lactonic SLs, these were also able to inhibit the biofilm formation. No cytotoxic effects in human HaCaT cells were observed in all the evaluated compounds. Lactonic SLs may stand for an interesting approach in preventing biofilm formation on medical devices surfaces as well as the conjugation of the SLs with the silicone surface.
The use of medical devices such as catheters, endotracheal tubes and pacemakers is certainly lifesaving nevertheless it can lead to medical devices associated infections. The biofilms formed on the devices surface are a challenging subject all over the world, since the use of antibiotics can trigger antimicrobial resistance and few alternatives are available for the infection treatment. The aim of this thesis was to synthesize, characterize, purify different sophorolipids (SLs) and functionalize medical grade silicone surface with the most active compounds in order to evaluate the biomaterial antimicrobial properties. SLs were biosynthesized in a glucose peptone yeast extract seed culture media, supplemented with borage oil or oleic acid, by Starmerella bombicola. The compounds obtained were isolated by flash chromatography or solid phase extraction and characterized by Ultra-performance liquid chromatography coupled to mass spectrometry and Nuclear Magnetic Resonance. Additionally, an alkaline hydrolysis was performed to obtain an acid SL. Silicone surface was functionalized with the SLs by adsorption or chemical-etching and specimens antimicrobial activity was evaluated against the bacteria Staphylococcus aureus ATCC 25923, as well as their biocompatibility towards the HaCaT human cells. Lactonic compounds with different unsaturation degrees (i.e. C18:0, C18:1, C18:2 and C18:3 lactonic diacetylated SLs) were isolated, as well as an acidic SL obtained from the alkaline hydrolysis and a derivative with a terminal amide bond. Compounds with a lower unsaturation degree (i.e. C18:0 and C18:1 lactonic diacetylated SLs) and lactonic SLs mixture presented higher antibiofilm activity against Staphylococcus aureus ATCC 25923 by adsorption, showing approximate 100 % biofilm inhibition and a 6 and 5 log reduction on the number of colonies formed. The conjugation of the acidic SL and the initial SLs mixture by chemical-etching also showed a decrease on the biofilm formation (40% and 70%, respectively). Although the acidic compounds did not reveal so great results as the lactonic SLs, these were also able to inhibit the biofilm formation. No cytotoxic effects in human HaCaT cells were observed in all the evaluated compounds. Lactonic SLs may stand for an interesting approach in preventing biofilm formation on medical devices surfaces as well as the conjugation of the SLs with the silicone surface.
Descrição
Tese de mestrado, Química Farmacêutica e Terapêutica, 2020, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia.
Palavras-chave
Infection Antibiofilm activity Catheters Sophorolipids Silicone functionalization Teses de mestrado - 2020