Publicação
Novel Strategy to Detect and Localize Latent HIV Reservoirs
| datacite.subject.fos | Ciências da Saúde | pt_PT |
| dc.contributor.advisor | Gonçalves, João | |
| dc.contributor.author | Cardoso, Miguel Gomes | |
| dc.date.accessioned | 2018-06-20T15:34:48Z | |
| dc.date.available | 2019-09-30T00:30:20Z | |
| dc.date.issued | 2017-12-06 | |
| dc.date.submitted | 2017-09-29 | |
| dc.description | Tese de mestrado, Ciências Biofarmacêuticas, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2017 | pt_PT |
| dc.description.abstract | Over the years, the scientific eagerness to find a cure for human immunodeficiency virus (HIV) led us to, try after try, be closer to finding it. For the first time, in 1996, appears a new therapeutic strategy that consists in combinations of different antiretroviral drugs. Over the last years, the most used therapy against HIV has been combinational antiretroviral therapy (cART) although, it is not able to eradicate HIV from the host due to HIV latency. The cART works by stopping the replication cycle of HIV, but, when the virus is latent, its replication cycle is interrupted, thus making impossible for cART to fully eliminate the provirus from the host. Nowadays, the HIV/acquired immunodeficiency syndrome (AIDS) research has the goal to discover the answer to the question of the last years: what is the best method to reactivate the latent HIV? There are records of a wide range of compounds that can stimulate the HIV reactivation (latency-reversing agents – LRAs), but everyone has a disadvantage or a low efficacy in vivo. The search for a more efficient and specific non-toxic LRA has greatly increased. New strategies have emerged that consist in the combination of more potent LRAs with specific vehicles to delivery. Cell receptors have the ability to generate a response after the binding of an antigen. These receptors can be customized allowing to choose the sensing and response behaviors. With this new concept, we developed a strategy that comprehends the reactivation of latent reservoirs upon receptor recognition and the induction of T cell activation which leads to the death of the infected cell. Here, our results shown that the developed receptor is capable of sensing surface-expressed gp120 and inducing the expression of a reporter vector allowing us to detect gp120+ cells. Thus, this customized cell response is a promising method to be employed as a therapeutic strategy after future optimizations. | pt_PT |
| dc.description.abstract | O vírus da imunodeficiência humana (do inglês, HIV) é responsável pela síndrome da imunodeficiência adquirida (SIDA), uma doença que debilita o sistema imunitário ficando sem capacidade para combater infecções oportunistas. O HIV-1 reconhece diferentes receptores presentes na superfície dos linfócitos T e de outras células, como monócitos, células dendríticas e macrófagos, levando à fusão do virião com a membrana celular. Inicialmente, a proteína gp120 liga-se ao receptor CD4 e, de seguida, a um dos co-receptores, CCR5 ou CXCR4, aproximando a proteína gp41 da superfície celular e resultando na fusão com a célula. O RNA viral, após a entrada do vírus, é convertido em DNA pela transcriptase reversa e logo transportado para o núcleo onde será integrado no genoma da célula hospedeira. Finalmente, a célula inicia a transcrição e tradução das proteínas virais para formar novas partículas virais que, depois de secretadas, irão infectar novas células após sofrerem maturação. As terapias actualmente utilizadas para o tratamento desta infecção, dependem da replicação activa do vírus para serem eficazes. Estas consistem na combinação de diferentes fármacos antiretrovirais que têm como alvo diferentes passos do ciclo replicativo do HIV-1. Assim, os reservatórios latentes existentes no organismo do hospedeiro tornam-se o maior obstáculo à erradicação do vírus. Estes são compostos por células infectadas num estado de latência, que é definido pela ausência de transcrição viral, e por isso, a terapia combinatória antiretroviral (cART) é incapaz de eliminar estas células. As principais células que formam os reservatórios são linfócitos T CD4+ de memória que têm um tempo de meia-vida aproximadamente igual a 44 meses, estimando-se que demoraria cerca de 73 anos para eliminar totalmente o HIV-1 do hospedeiro apenas com cART. Dada a incapacidade das terapias actuais erradicarem o HIV-1 do organismo, têm vindo a emergir vários estudos que procuram desenvolver estratégias inovadoras para ultrapassar o obstáculo que são os reservatórios latentes. As novas abordagens terapêuticas têm de ser capazes de eliminar as células latentes de forma específica, como acontece com a terapia génica e a terapia celular. Também têm sido estudadas outras abordagens que dependem da reactivação das células latentes, pois mostraram ser um método que tanto possibilita o sistema imunitário de reconhecer essas células como infectadas e então induzir a sua morte, como também possibilita que as terapias correntes sejam eficazes visto que, as células passam a ter o ciclo de replicação do HIV-1 activo. O mecanismo mais utilizado para reactivar as células consiste na indução de cascatas de sinalização que leva à activação da transcrição do genoma do HIV-1 e consequentemente, à produção viral. Estudos revelam que a estimulação do receptor TLR5 pela flagelina remove as células do seu estado de latência. Este receptor tem um papel importante na imunidade inata e tem como mecanismo de transdução de sinal a activação do NF-κB que, por sua vez, activa a transcrição. Na terapia celular, células são modificadas para expressar receptores sintéticos específicos que reconhecem antigénios associados a doenças. As células expressam naturalmente receptores que têm papeis importantes no desenvolvimento e manutenção celular em tecidos. Estudos actuais estão focados no estudo de estratégias promissoras que têm como base os mecanismos de activação e de transdução de sinal destes receptores. Um receptor que se mostrou bastante promissor foi o receptor Notch, pois não necessita de mensageiros secundários para a transdução de sinal e porque tanto o domínio de reconhecimento (extracelular) como o domínio intracelular são facilmente personalizados. Os receptores synNotch providenciam flexibilidade na modificação dos seus domínios concedendo a capacidade de especificar o alvo molecular e a resposta do receptor ao estímulo. Através da transdução de células, são criadas linhas celulares que, ao reconhecerem células específicas, têm uma resposta pré-definida. Baseando-nos nestas estratégias, propusemo-nos a desenvolver um receptor (VRC01_synNotch) capaz de detectar a presença de gp120 na superfície celular e, quando estimulado activa a expressão de um vector repórter fluorescente. Este receptor é o primeiro passo para o desenvolvimento de uma estratégia que consiste na detecção de linfócitos T CD4+ de memória induzindo a expressão de flagelina que activará a célula de memória e do receptor VCR01_synNotch. Caso esta célula esteja infectada, passará a expressar as proteínas virais, nomeadamente a gp120, que, depois do receptor VRC01_synNotch a reconhecer, será desencadeada a activação do linfócito T eliminando a célula infectada. Para avaliar o funcionamento deste receptor também criámos células que expressam os antigénios alvo. No caso do VRC01_synNotch, as células alvo expressam gp120 à superfície e, no caso do controlo positivo (LaG17_synNotch) que reconhece a proteína EGFP, as células alvo expressam uma versão modificada da EGFP à superfície da célula. Depois de várias optimizações da expressão do receptor LaG17_synNotch, as células com o receptor tiveram uma activação de 15% após a co-cultura com células EGFP+. De forma a tentar aumentar o nível de expressão de tBFP, decidimos usar apenas células Jurkat como células receptoras e apresentadoras. Depois de criadas, as células foram outra vez incubadas em co-cultura e, após a análise por citometria de fluxo, as células LaG17_synNotch+ apresentaram, no máximo, 5.3% de células positivas para tBFP e as VRC01_synNotch+ apresentaram, no máximo, 2.29% de células tBFP+. Apesar das células terem mais facilidade na interacção célula-a-célula, o número de células transduzidas com êxito foi baixo, com excepção das células EGFP+, havendo pouca estimulação dos receptores e consequente activação. As células infectadas quando estão no estado de latência são indistinguíveis das outras células não infectadas. Ao reactivar estas células, como o genoma do HIV-1 começa a ser expresso, proteínas específicas da infecção, como a gp120, são transportadas para a superfície da célula. A presença destes antigénios nas células facilita o desenvolvimento de abordagens específicas. Para isso, foi estudado o efeito da flagelina na reactivação de células latentes (J-Lat 10.6) e também na expressão do receptor (Fas) e do ligando (FasL) que estão associados à sinalização da apoptose. Os resultados que obtivemos demonstraram que a estimulação da flagelina não afecta a expressão de Fas/FasL, mas é capaz de reactivar 80% das células latentes. No futuro, as células transduzidas têm de ser separadas e purificadas (cell sorting) para optimizar os ensaios de activação e assim estudar detalhadamente as interacções entre as células receptoras e as células apresentadoras. Têm de ser desenvolvidos novos receptores que reconheçam os marcadores de células de memória (CD44 ou CD32a) e levem à expressão da flagelina para reactivar a célula latente. Um estudo pioneiro identificou a proteína CD32a como um antigénio com elevada expressão em células de memória latentes, que poderá ser utilizada numa abordagem independente da reactivação. Por fim, o receptor VRC01_synNotch tem de ser modificado para que, após estimulação com gp120, a célula receptora seja activada induzindo a morte da célula infectada. Os resultados apresentados neste trabalho demostraram que o receptor desenvolvido é capaz de induzir uma resposta específica após o reconhecimento de gp120 expresso na superfície da célula. Através de modificações dos domínios do receptor, podemos obter respostas personalizadas a específicos estímulos. Para obter respostas mais complexas, podem-se combinar diferentes receptores de forma a obter uma reposta apenas quando dois ou mais antigénios são reconhecidos. Concluindo, estes receptores mostraram ser uma promissora abordagem para erradicação do HIV-1. | pt_PT |
| dc.identifier.tid | 201830736 | pt_PT |
| dc.identifier.uri | http://hdl.handle.net/10451/34001 | |
| dc.language.iso | eng | pt_PT |
| dc.subject | HIV-1 | pt_PT |
| dc.subject | Latency | pt_PT |
| dc.subject | Notch receptors | pt_PT |
| dc.subject | Reactivation | pt_PT |
| dc.subject | T Cell engineering | pt_PT |
| dc.subject | Tese de mestrado - 2017 | pt_PT |
| dc.title | Novel Strategy to Detect and Localize Latent HIV Reservoirs | pt_PT |
| dc.type | master thesis | |
| dspace.entity.type | Publication | |
| rcaap.embargofct | Publicação dos resultados em revista científica internacional | pt_PT |
| rcaap.rights | embargoedAccess | pt_PT |
| rcaap.type | masterThesis | pt_PT |
| thesis.degree.name | Mestrado em Ciências Biofarmacêuticas | pt_PT |