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Mechanisms of protein dysfunction in mitochondrial leukodystrophies – studies on glutamyl-tRNA synthetase (EARS2)
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Autores
Orientador(es)
Resumo(s)
Doenças mitocondriais (MD) são um grupo de doenças metabólicas causadas por defeitos
genéticos que afetam a fosforilação oxidativa e, consequentemente, a produção de ATP nas células.
Estas doenças são clinicamente heterogéneas, podendo surgir em qualquer idade e apresentando uma
grande diversidade de sintomas clínicos, o que torna o diagnóstico e gestão das mesmas extremamente
complexo. No entanto, com o desenvolvimento de técnicas de sequenciação de nova geração (NGS), a
identificação de variantes genéticas patogénicas tornou-se mais fácil, permitindo a identificação de
novas categorias de MDs, tais como as doenças associadas às proteínas aminoacil-tRNA sintetases
mitocondriais (mt-aaRSs). Estas enzimas são fundamentais para a tradução da informação genética na
mitocôndria, uma vez que catalisam a reação de aminoacilação, isto é, a esterificação que liga um dos
20 aminoácidos ao respetivo tRNA mitocondrial. De facto, mutações em todas as mt-aaRSs, incluindo
casos reportados em Portugal, têm sido identificadas, predominantemente com fenótipos associados ao
sistema nervoso central (CNS). Todavia, apesar das enzimas catalisarem reações idênticas, as doenças
a elas associadas apresentam fenótipos distintos e manifestações clínicas específicas, dependendo de
qual enzima é afetada. Devido à escassez de informação relativamente aos mecanismos moleculares
envolvidos e à caracterização das próprias enzimas, o desenvolvimento de terapias é complicado, sendo
que poucas opções de tratamento estão atualmente disponíveis.
Assim, para estabelecer correlações genótipo-fenótipo nas doenças associadas a defeitos das mtaaRSs, o estudo em questão foca-se na proteína glutamil-tRNA sintetase mitocondrial humana
(EARS2), que catalisa especificamente a reação de esterificação do glutamato ao seu respetivo tRNA
mitocondrial. O objetivo deste trabalho é compreender como mutações nesta proteína podem afetar a
sua estrutura e estabilidade, e possivelmente estabelecer correlações com a severidade da doença
leucoencefalopatia com envolvimento do tálamo e do tronco encefálico e elevação do lactato (LTBL) a
que está associada. Em particular, o propósito deste estudo é purificar e caracterizar estruturalmente,
recorrendo a métodos bioquímicos e biofísicos, as proteínas wild-type (EARS2-WT) e três variantes
clínicas (p.Glu96Lys, p.Gly110Ser e p.Arg489Gln).
Primeiramente, fez-se uma análise in silico para avaliar os possíveis efeitos das mutações nas
propriedades e estrutura da proteína. As mutações selecionadas para estudo localizam-se em diferentes
domínios da EARS2: as mutações pontuais Glu96Lys e Gly110Ser encontram-se no domínio catalítico,
mas fora da cavidade do centro ativo, e a mutação Arg489Gln localiza-se no domínio de ligação ao
anticodão, em uma posição conservada, potencialmente envolvida na interação com o tRNA. No caso
da mutação Glu96Lys, a substituição de um glutamato carregado negativamente, exposto na superfície
da proteína, por uma lisina carregada positivamente pode alterar as propriedades eletrostáticas, a
conformação e solubilidade da proteína. Todos os doentes portadores de mutações em mt-aaRSs são
heterozigotos compostos e, uma vez que estas proteínas são essenciais para o organismo, uma ou ambas
as mutações têm de permitir sempre alguma atividade residual. Considerando um caso reportado da
mutação Glu96Lys emparelhado com a mutação p.Met1?, que afeta o codão de iniciação e está associada
a mutações severas, é possível que a mutação Glu96Lys tenha um fenótipo mais moderado, permitindo
alguma atividade da proteína. Relativamente à mutação Gly110Ser, a substituição de uma glicina, um
aminoácido com apenas um hidrogénio como cadeia lateral, por uma serina com um grupo hidroxilo
que pode formar ligações de hidrogénio com outras moléculas, poderia afetar a estrutura da proteína.
Quanto à mutação Arg489Gln, a substituição, numa posição conservada, de uma arginina carregada
positivamente por uma glutamina, sem carga, mas polar, poderia alterar severamente a atividade da
proteína. Todavia, apesar das observações anteriores, nenhuma mutação afetou substancialmente a
estrutura tridimensional da proteína prevista pelo programa de previsão de estruturas AlphaFold. Experimentalmente foram inicialmente avaliadas as melhores condições de expressão
heteróloga das variantes da EARS2 em células Rosetta, uma estirpe de E. coli desenvolvida para
melhorar a expressão de proteínas eucarióticas que contém codões raramente usados pela bactéria.
Foram testadas diferentes temperaturas de crescimento e diferentes concentrações de IPTG para induzir
a expressão proteica. A melhor condição para obter EARS2-WT na fração solúvel foi crescimento a
22 ºC com indução de expressão com 0.5 mM IPTG, durante a noite. No entanto, relativamente às
variantes clínicas, esta condição não foi suficiente para a expressão solúvel das mesmas, apresentando
exclusivamente expressão em corpos de inclusão (IBs). Para resgatar as proteínas para a fração solúvel,
foi usado um protocolo de co-expressão com a chaperona molecular GroEL-GroES, que assiste as
proteínas durante o folding proteico. A partir deste protocolo, foi possível expressar as variantes clínicas
da EARS2 na fração solúvel, no entanto, apenas com efeitos pronunciados na variante EARS2-E96K, o
que possibilitou a sua purificação. Desta forma, foram purificadas a EARS2-WT e a EARS2-E96K
recorrendo a uma cromatografia de afinidade numa coluna His-Trap, obtendo-se uma pureza maior que
90% para a EARS2-WT e maior que 75%, com uma pequena contaminação por GroEL, para a EARS2-
E96K.
Seguidamente, para avaliar a estrutura e o estado conformacional das variantes EARS2, usaramse técnicas biofísicas, como dicroísmo circular (CD) para analisar a estrutura secundária e
espectroscopia de fluorescência de emissão dos triptofanos para analisar a estrutura terciária. A EARS2
apresenta uma estrutura maioritariamente composta por ɑ-hélices, correspondente à estrutura prevista
pelo programa AlphaFold, com os triptofanos parcialmente ocluídos na estrutura da proteína. Em geral,
a mutação E96K não parece afetar a conformação da proteína, mas foi possível observar uma diminuição
na intensidade da emissão de fluorescência dos triptofanos da EARS2-WT para a EARS2-E96K,
provavelmente devido à alteração do ambiente do triptofano em redor da mutação pontual.
A estabilidade estrutural foi avaliada recorrendo às mesmas técnicas. A EARS2-E96K
apresentou uma menor estabilidade térmica em comparação com a EARS2-WT, com uma diferença de
4 ºC na temperatura aparente de desnaturação, em termos de estrutura secundária e terciária. Foi utilizada
também a técnica de fluorimetria de varrimento diferencial (DSF) para testar o impacto de diferentes
condições de pH e aditivos, como sal e substratos, na estabilidade térmica da EARS2. Em todas as
condições testadas, a EARS2-E96K teve consistentemente menor estabilidade térmica que a proteína
WT. Em termos de pH, ambas as proteínas são mais estáveis próximo do pH 7, mas a variante clínica é
mais instável em pHs alcalinos. Isto indica uma possível alteração nas interações eletrostáticas devido à
mutação E96K. Relativamente aos diferentes sais testados, os sais compostos por catiões monovalentes
apresentaram um efeito estabilizador, enquanto os compostos por catiões divalentes apresentaram um
efeito destabilizador a maiores concentrações. Apesar da menor estabilidade térmica da variante clínica,
ambas as proteínas tiveram comportamentos semelhantes quando submetidas aos mesmos sais. Em
relação aos substratos, ATP e glutamato, não foram observadas alterações na estabilidade térmica das
proteínas quando expostas isoladamente aos mesmos ou na presença de ambos. Esta observação está em
concordância com informações sobre a EARS de outros organismos, que necessitam do tRNA para
conseguirem ligar os outros substratos, devido a um rearranjo conformacional.
Para aprofundar a avaliação da estabilidade da EARS2, a estabilidade química foi também
analisada na presença de ureia, recorrendo à emissão de fluorescência dos triptofanos. A curva de
desnaturação obtida apresentou um comportamento com uma dupla transição, em contraste com as
curvas obtidas da desnaturação térmica, indicando um processo de desnaturação mais complexo.
Curiosamente, a primeira transição da EARS2-E96K ocorreu a concentrações mais baixas de ureia,
sugerindo uma menor estabilidade química em comparação com a EARS2-WT. Posteriormente, foi avaliada a suscetibilidade da EARS2 à degradação quando submetida a uma
proteólise limitada com tripsina. A 30 ºC, a EARS2-E96K foi digerida mais rapidamente que a EARS2-
WT. Após 60 minutos do decorrer da experiência, enquanto 70% da EARS2-E96K já tinha sido digerida,
apenas 50% da EARS2-WT foi degradada. Estes resultados indicam que a EARS2-E96K é mais
suscetível à digestão com tripsina, possivelmente por apresentar uma conformação com maior
flexibilidade como consequência da mutação.
Finalmente, a tendência da proteína para precipitar/agregar foi avaliada seguindo a dispersão de
luz usando como técnica a espectroscopia de fluorescência em ângulo reto. Após 20 minutos de
incubação a 37 ºC, verificou-se que a solução com EARS2-E96K atingiu o máximo de intensidade de
emissão, enquanto a EARS2-WT demorou mais de uma hora, indicando que a variante clínica é mais
propensa a precipitar/agregar.
Em conclusão, a implementação de protocolos de purificação para as mt-aaRSs e as suas
variantes clínicas pode facilitar a sua caracterização e, consequentemente, auxiliar no esclarecimento
dos mecanismos moleculares das doenças a elas associadas. Considerando que as relações genótipofenótipo são difíceis de identificar, é fundamental entender como as mutações podem estar a afetar as
proteínas a nível de estrutura, estabilidade e função, para possibilitar o desenvolvimento de novas
terapias.
Mitochondrial aminoacyl-tRNA synthetases (mt-aaRSs) catalyse the attachment of an amino acid to the corresponding tRNA and, consequently, they are crucial for the translation process in mitochondria. Indeed, mutations have been identified in all mt-aaRSs, with new mutations continually being discovered, including in Portugal. These mutations are associated with mitochondrial diseases, primarily affecting the central nervous system, and manifesting in a variety of distinct phenotypes and clinical symptoms, which vary depending on the specific mt-aaRS affected. However, the selective vulnerability and molecular mechanisms underlying these pathologies remain unclear, and these proteins are still poorly characterized. Therefore, it is critical to understand the impact of identified mutations on the proteins’ structure, conformational stability and function. To uncover potential genotype-phenotype correlations, we aimed to study mitochondrial glutamyl-tRNA synthetase (EARS2) using biochemical and biophysical methods to purify and structurally characterize the human EARS2 wild-type and three disease-related variants (p.Glu96Lys, p.Gly110Ser, and p.Arg489Gln) associated with leukoencephalopathy with thalamus and brainstem involvement and high lactate (LTBL). EARS2 proteins were heterologous expressed in E. coli, with the disease-related variants expressed at lower yields than EARS2-WT. EARS2-E96K was co-expressed with the molecular chaperone GroEL-GroES, allowing its soluble expression. We succeed in purifying EARS2-WT and EARS2-E96K with a purity grade of over 90% and 75%, respectively. Secondary and tertiary structure analysis revealed that the missense mutation E96K does not affect the folded conformation of EARS2. However, the disease-related variant exhibited diminished thermal stability, with an apparent melting temperature 4 °C lower than the wild-type protein, which presents a Tm app of 42 ºC. EARS2-E96K also showed consistently lower chemical stability, greater susceptibility to proteolysis degradation, and increased propensity to precipitation. In conclusion, implementing purification protocols for mt-aaRSs facilitates the characterization of disease-related variants, thereby opening new avenues for clarifying disease mechanisms and ultimately aiding in the development of targeted therapies.
Mitochondrial aminoacyl-tRNA synthetases (mt-aaRSs) catalyse the attachment of an amino acid to the corresponding tRNA and, consequently, they are crucial for the translation process in mitochondria. Indeed, mutations have been identified in all mt-aaRSs, with new mutations continually being discovered, including in Portugal. These mutations are associated with mitochondrial diseases, primarily affecting the central nervous system, and manifesting in a variety of distinct phenotypes and clinical symptoms, which vary depending on the specific mt-aaRS affected. However, the selective vulnerability and molecular mechanisms underlying these pathologies remain unclear, and these proteins are still poorly characterized. Therefore, it is critical to understand the impact of identified mutations on the proteins’ structure, conformational stability and function. To uncover potential genotype-phenotype correlations, we aimed to study mitochondrial glutamyl-tRNA synthetase (EARS2) using biochemical and biophysical methods to purify and structurally characterize the human EARS2 wild-type and three disease-related variants (p.Glu96Lys, p.Gly110Ser, and p.Arg489Gln) associated with leukoencephalopathy with thalamus and brainstem involvement and high lactate (LTBL). EARS2 proteins were heterologous expressed in E. coli, with the disease-related variants expressed at lower yields than EARS2-WT. EARS2-E96K was co-expressed with the molecular chaperone GroEL-GroES, allowing its soluble expression. We succeed in purifying EARS2-WT and EARS2-E96K with a purity grade of over 90% and 75%, respectively. Secondary and tertiary structure analysis revealed that the missense mutation E96K does not affect the folded conformation of EARS2. However, the disease-related variant exhibited diminished thermal stability, with an apparent melting temperature 4 °C lower than the wild-type protein, which presents a Tm app of 42 ºC. EARS2-E96K also showed consistently lower chemical stability, greater susceptibility to proteolysis degradation, and increased propensity to precipitation. In conclusion, implementing purification protocols for mt-aaRSs facilitates the characterization of disease-related variants, thereby opening new avenues for clarifying disease mechanisms and ultimately aiding in the development of targeted therapies.
Descrição
Tese de Mestrado, Bioquímica e Biomedicina, 2024, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências
Palavras-chave
Aminoacil-tRNA sintetases mitocondriais Leucoencefalopatia Folding proteico Estabilidade conformacional Teses de mestrado - 2024