Searching for ‘hotspots’ of dopamine neuron degeneration leading to different motor symptoms

Barbosa, Henrique Manuel Martinho

http://hdl.handle.net/10451/64338

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Authors

Barbosa, Henrique Manuel Martinho

Advisor(s)

Silva, Joaquim Alves da

Andrade, Alexandre da Rocha Freire de

Abstract(s)

A doença de Parkinson foi identificada pela primeira vez em 1817 pelo médico britânico James Parkinson, que descreveu os seus sintomas característicos como tremores, rigidez muscular e problemas de iniciação de movimento. Hoje, esta doença é reconhecida como uma doença neurodegenerativa progressiva que afeta principalmente o sistema nervoso central. Ela é diagnosticada clinicamente com base em sintomas motores, como tremor, rigidez e lentificação de movimento, bem como sintomas não motores, como distúrbios do sono, perda do olfato e depressão. Esses sintomas não motores têm um impacto significativo na qualidade de vida dos pacientes, afetando quase 90% dos pacientes com Parkinson ao longo do tempo. A neuropatologia desta doença envolve três aspetos-chave: disfunção dopaminérgica, agregação de αsinucleína e formação de corpos de Lewy. Os neurônios dopaminérgicos em regiões cerebrais específicas, incluindo a substância negra pars compacta, degeneram, levando a um desequilíbrio nos circuitos cerebrais e causando os sintomas motores típicos. Em pacientes com Parkinson, a α-sinucleína, uma proteína que regula a liberação de neurotransmissores, dobra-se de forma anormal e agrega-se, resultando na formação de agregados proteicos prejudiciais conhecidos como corpos de Lewy. Esses agregados perturbam várias funções celulares e contribuem para a degeneração cerebral. Embora a causa da doença de Parkinson ainda não seja clara, compreender a sua neuropatologia e a sua relação com o modelo dos gânglios da base fornece informações cruciais para pesquisas em andamento e a nossa compreensão sobre esta doença complexa. Apesar dos avanços na pesquisa da neuropatologia da Doença de Parkinson, a sua causa exata permanece desconhecida. As teorias predominantes incluem fatores ambientais e genéticos. Acredita-se que a doença de Parkinson seja uma condição complexa, influenciada por predisposição genética e exposição ambiental. O envelhecimento é um fator de risco bem estabelecido, embora seu impacto seja incerto, visto que as alterações neuroquímicas relacionadas com a idade não explicam completamente o desenvolvimento da doença. A exposição a pesticidas é um importante fator ambiental ligado ao risco de Parkinson. Alguns estudos associam o contato prolongado com substâncias como o rotenone a danos específicos nas células produtoras de dopamina. A genética também desempenha um papel, com cerca de 15% dos pacientes com doença de Parkinson a terem parentes de primeiro grau afetados. No entanto, a maioria dos casos não é diretamente hereditária, sendo, em vez disso, esporádica A Doença de Parkinson, tal como referido, é uma condição neurológica caracterizada por uma ampla variedade de sintomas motores. Isso levou à hipótese de que diferentes subtipos de Parkinson existem, com base nas áreas cerebrais afetadas e nos circuitos neurais envolvidos. Os principais subtipos incluem tremor dominant e non tremor dominant, que abrange instabilidade postural e problemas de deslocamento (PIGD) e acinético-rígido. O diagnóstico clínico da doença de Parkinson depende da identificação do sintoma motor predominante, como bradicinesia, tremor ou rigidez, usando a MDS-UPDRS (The Movement Disorder SocietySponsored Revision of the Unified Parkinson's Disease Rating Scale). No entanto, essa abordagem simplificada pode não capturar a complexidade dos subtipos desta doença. Estudos neuropatológicos e em primatas não humanos sugerem que pacientes tremor dominant têm maior perda de neurónios na área retrorubral, enquanto os pacientes non tremor dominant perdem mais neurônios na substância negra pars compacta. Isso pode ter implicações na progressão da doença e nas respostas ao tratamento. Além disso, estudos em seres humanos têm explorado a existência de subtipos da doença, mas há desafios relacionados com a obtenção de informações neuropatológicas ao longo da vida do paciente. A pesquisa em primatas não humanos, usando substâncias neurotóxicas, como o MPTP, também contribuiu para a compreensão desses subtipos. A busca por subtipos de Parkinson é crucial para desenvolver terapias mais especializadas e individualizadas para pacientes com diferentes apresentações da doença. No entanto, na pesquisa em humanos, há uma falta de informações neuropatológicas sobre a morte de neurônios dopaminérgicos ao longo da vida do paciente. Já nos estudos em primatas não humanos, as principais dificuldades incluem o pequeno número de sujeitos e a falta de especificidade dos vírus usados para destruir seletivamente neurônios dopaminérgicos, impossibilitando a confirmação de diferentes fenótipos resultantes da ablação específica desses neurônios. Com as dificuldades encontradas em estudos em humanos e primatas não humanos, os cientistas recorreram a modelos animais de roedores para superar os desafios na obtenção de evidências convincentes que comprovem a existência de múltiplas vias neuropatológicas resultando em diferentes subtipos de pacientes com Doença de Parkinson (DP). Numa tentativa de superar as lacunas existentes nos estudos científicos na compreensão da doença de Parkinson, o grupo NCD da Champalimaud Foundation com a ajuda da plataforma de Hardware, desenvolveu um novo método usando um sensor de movimento de 9 eixos sem fio e miniaturizado. Foi aplicada esta tecnologia para monitorizar a progressão da doença em murganhos do modelo Mitopark, que apresentam características semelhantes à doença de Parkinson. O modelo de Mitopark foi desenvolvido para induzir falha mitocondrial, particularmente em neurônios dopaminérgicos, por meio da deleção celular do fator de transcrição mitocondrial A (Tfam). Estes murganhos apresentam redução nos níveis de dopamina e déficits no sistema motor, mimetizando algumas características fenotípicas da doença de Parkinson. A aplicação deste sensor de movimento, surgiu como uma abordagem viável para detetar automaticamente sintomas da doença de Parkinson. O estudo desenvolvido pela minha equipa revelou um aumento na bradicinesia e um padrão rítmico específico na faixa de frequência de 10-15 Hz, denominado tremor de movimento, à medida que os Mitopark perdiam neurônios dopaminérgicos. No entanto, devido à morte de todos os neurônios dopaminérgicos neste modelo, foi difícil determinar quais os neurônios responsáveis pelo tremor. Para abordar essa questão, utilizamos um vírus (AAV5-flextaCasp3-TEVp) para induzir a perda seletiva de neurônios dopaminérgicos no mesencéfalo e criar diferentes modelos de murganhos dominantes de tremor ou de bradicinesia, usando o modelo de murganho DAT-ires-cre. O objetivo principal deste projeto foi avaliar possíveis os "pontos críticos" de degeneração entre os neurónios dopaminérgicos, que têm uma correlação mais forte com o tremor do que com a bradicinesia. Após a identificação dessas áreas, usámos ratos DAT-ires-cre para realizar ablações específicas das áreas de neurónios dopaminérgicos na região do mesencéfalo através da indução de um vírus adeno-associado que contem um gene floxed Casp3 que leva à apoptose progressiva destes neurónios, com o objetivo de criar modelos de ratos que enfatizavam o tremor ou bradicinesia. Num grupo de ratos composto por cinco murganhos, injetámos o vírus na substantia nigra com o objetivo de induzir bradicinesia, preferencialmente, e no outro grupo, também constituídos por cinco animais, injetámos o vírus na RRF com o objetivo de obtermos um fenótipo de tremor mais intenso. O último grupo, de quatro animais, serviu como controlo. A avaliação do comportamento dos ratos foi realizada em duas etapas. Primeiro, observámos o comportamento durante meia hora no openfield e, em seguida, observámos o comportamento dos animais durante uma hora e meia na sua gaiola. Na primeira fase os dados obtidos durante períodos de mobilidade prolongados foram ideais para avaliar a bradicinesia e na segunda fase de gravação, o objetivo foi avaliar os períodos de maior imobilidade que nos permitiu avaliar o tremor enquanto os ratos estão em repouso. O nosso principal meio de avaliação do comportamento envolveu um sensor de movimento miniaturizado e leve (<2g) de 9 eixos (medindo aceleração 3D, velocidade angular e direção). Após a avaliação do comportamento dos animais, recolhemos e fatiámos os cérebros dos murganhos. Os neurónios dopaminérgicos destes animais foram identificados através da utilização do anticorpo antitirosina hidroxilase (anti-TH). Após realizarmos todos as metas a que nos propusemos durante esta experiência obtivemos uma visão mais abrangente das alterações comportamentais relacionadas com a degeneração dos neurónios dopaminérgicos. Embora os resultados não tenham sido tão distintos entre os grupos como antecipávamos, dentro dos grupos da SN e RRF, houve heterogeneidade que não existia no grupo de controlo, compatível com a ideia de que diferenças na degeneração dopaminérgica podem modular a apresentação dos sintomas da doença de Parkinson. É importante salientar que, para obter resultados mais robustos e estatisticamente significativos, é necessário aumentar o número de animais em cada um dos grupos experimentais. Este tamanho de amostra maior aumentaria a clareza das diferenças e forneceria uma base mais sólida para compreender os subtipos distintos da doença de Parkinson associados à degeneração nestes núcleos específicos. A avaliação histológica abrangente, que inclui a quantificação precisa e a localização da degeneração em diversos modelos de ratos, abre a possibilidade de identificar novos e altamente específicos 'pontos críticos' que transcendem as divisões anatómicas tradicionais da SNc e RRF. Esta abordagem permitirá uma compreensão mais refinada dos processos patológicos subjacentes à doença de Parkinson, potencialmente abrindo caminho para novos alvos terapêuticos e insights sobre as complexidades da degeneração dos neurónios dopaminérgicos.

Parkinson's disease, first identified in 1817 by James Parkinson, is a neurological condition characterized by tremors, muscle rigidity, and movement problems. It is clinically diagnosed based on motor symptoms and non-motor symptoms. The main subtypes are tremor-dominant and nontremor/bradykinesia dominant. Neuropathological studies suggest that tremor-dominant patients experience greater loss of neurons in the retrorubral area, while non-tremor-dominant patients lose more neurons in the substantia nigra. However, due to lack of information, it is impossible to confirm different phenotypes resulting from specific ablation of neurons. To overcome the gaps in scientific studies understanding Parkinson's, the NCD group at the Champalimaud Foundation, developed a new method using a miniaturized, wireless 9-axis motion sensor. This technology was applied to monitor disease progression in Mitopark mouse models, which exhibit similar characteristics to Parkinson's disease. The application of this motion sensor emerged as a viable approach to automatically detect Parkinson's disease symptoms and the study conducted revealed an increase in bradykinesia and a specific rhythmic pattern in the frequency range of 10-15 Hz, referred to as movement tremor. The study used a virus (AAV5-flex-taCasp3-TEVp) to induce selective loss of dopaminergic neurons in the mesencephalon and create mouse models with dominant tremor or bradykinesia using the DAT-irescre mouse model. The virus was injected into three groups, some in the substantia nigra area, others in the retrorubral area, and a control group. The virus was used to reproduce Parkinson's models with dopaminergic degeneration in different brain areas, histologically confirmed. Differences were observed between the different groups of animals in the SN and RRF regions compared to controls. However, the differences between the substantia nigra (SN) and retrorubral field (RRF) groups were not as evident as expected due to the limited number of animals used in the experiment.