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Publicação
LET-and radiation quality-dependence of the complexity of DNA damages
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Autores
Resumo(s)
Esta tese aborda o estudo dos efeitos biol´ogicos induzidos por exposição à radiação-alfa (_) em células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC) e por exposição às radiações alfa e gama () em células saudáveis (não cancerígenas) da próstata humana (RWPE-1). A radiação ionizante pode interagir de duas formas com o DNA (o principal alvo da radiação ionizante): diretamente, ao quebrar as ligações dos pares de bases da cadeia de DNA, ou indiretamente, ao quebrar as ligações de moléculas de água envolventes dando origem a radicais livres que podem interagir com a molécula de DNA. Existem vários tipos de danos, entre eles danos de base (base damage) ou singlestrand breaks, mas os mais graves são os double-strand breaks (DSBs), isto é, quando a radiação é capaz de quebrar as ligações de dois pares de bases (pb, ou, em inglês, bp, base pairs), no mínimo, que distam a 10 bp ou menos e em cadeias opostas. Estas quebras podem resultar na clivagem da molécula de DNA e a célula pode não conseguir repará-las, dando a origem a mutações ou outros efeitos biológicos graves. Quando existe um DSB numa molécula de DNA, começa a existir um aglomerado de proteínas reparadoras nessa zona, proteínas essas que podem ser marcadas com marcadores florescentes e, posteriormente, serem observadas com a técnica de microscopia de florescência como focos (pequenos objetos circulares fluorescentes). Numa altura em que a radioterapia está a ganhar cada vez mais interesse e terreno nas opções de tratamento contra o cancro, é importante perceber como diferentes radiações causam danos nas moléculas de DNA. Numa primeira parte, fez-se um estudo estatístico de dados recolhidos numa experiencia levada a cabo em 2014, no PTB, realizado pelos orientadores. Nesta experiencia células HUVEC foram expostas a radiaço alfa de várias energias (8, 10 e 20 MeV) e a protões de 3 MeV. O PTB possui um sistema de microfeixe capaz de controlar o número de partículas emitido e o local onde são emitidas, dado a possibilidade de atingir diretamente o núcleo das células, em contrapartida aos broadbeam, que irradiam toda a área exposta. Desta maneira podemos controlar o número de focos que esperamos observar em fluorescência. Após uma etapa de reconhecimento das células, cada núcleo reconhecido foi exposto a 5 partículas do tipo de radiação em causa, no padrão quincunce (semelhante ao lado 5 de um dado). Após a radiação, seguiu-se o protocolo do ensaio de focos (Foci Assay). O objetivo deste estudo passou por tentar obter, para cada qualidade de radiação, uma estimativa para a probabilidade de uma partícula dessa radiação induzir um dano na cadeia de DNA. Para tal, as células expostas foram fotografadas com recurso a uma câmara acoplada a um microscópio de fluorescência e as imagens foram analisadas pelo software CellProfiler para identificação dos núcleos e do número de focos em cada um deles, bem como outras características de cada objeto, como intensidade e área. Os dados foram simulados como uma convolução entre uma função I(k) que representa os focos induzidos por radiação e uma função B(k), que representa os focos de background (devidos a manuseamento, stress, entre outras razões biológicas). Numa primeira abordagem verificou-se que B(k) seguia uma distribuição de decaimento exponencial, no entanto os processos básicos de limpeza de dados resultavam num ajuste fraco. Assim sendo, e como conhecer a função B(k) ou estimá-la corretamente é importante, o foco desta parte passou a ser encontrar a melhor função de ajuste B(k) aos dados aplicando valores limiares a parâmetros intrínsecos aos objetos como a intensidade total dos focos e a área dos núcleos. No que diz respeito à intensidade dos focos, aplicou-se valores limites entre 0 e 100. Em cada situação, focos com intensidade inferior ao limite eram descartados dos dados e procedeu-se ao ajuste de uma função de decaimento exponencial com parâmetros a (amplitude) e b (argumento da exponencial). Os ajustes foram comparados usando o teste do chi-quadrado Goodness of Fit. Neste teste os valores reais e obtidos pela função são comparados e o ajuste que apresenta o menor valor de chi-quadrado representa o melhor ajuste aos dados. Para a intensidade dos focos, verificou-se que o limite de 23 era o parâmetro ótimo (X2 = 0.070), registando uma melhoria em relação à situação em que nenhum limite é aplicado (X2 = 0.124). No passo seguinte, focámo-nos na área dos núcleos. Após observar a distribuição desta variável, escolheu-se três limites inferiores (4000, 7000 e 9000 pxl2) e três superiores (16000, 18000 e 21000 pxl2) e testou-se todas as combinações. O par de limites 7000/21000 (X2 = 0.0044) foi o que apresentou a maior melhoria no ajuste. Apesar da melhoria significativa na função B(k) e também numa notável melhoria na função de ajuste I(k), uma sobreposição linear de três binomiais de parâmetro p (probabilidade de induzir um dano), verificou-se que os parâmetros ótimos para os dados de background não são os mesmos para os dados de células irradiadas, pelo que o processo de limpeza destes últimos necessita de ser revisto no futuro. A segunda parte do trabalho tinha como objetivo avaliar o Relative Biological Effectiveness (RBE) de protões na linha celular RWPE-1, células saudáveis epiteliais da próstata humana, através do Ensaio Clonogénico. O cancro da próstata é tratado mundialmente com recurso à radioterapia, sendo os protões a radiação escolhida, pelo que é importante averiguar qual a resposta das células saudáveis, que são circundantes às células cancerígenas, a esta radiação. Devido a problemas experimentais e questões de calendário, não foi possível realizar a experiência usando um feixe de protões, pelo que se optou por fazer um estudo usando a fonte radioativa Amerício-241, emissora de partículas alfa. Um grupo de células foi exposto a 0.5, 1, 2, 4, 6 e 10 Gy de fotões de Cobalto-60 e um segundo grupo foi exposto a 0.25, 0.5, 1 e 2 Gy de partículas alfa de Am-241. Para os fotões, sendo uma radiação pouco ionizante, usou-se o Modelo Linear Quadrático para se obter um ajuste aos dados, com resultados αϒ = 0:47 +- 0:01 Gy-1 e ϐϒ = 0:006 +- 0:001 Gy-2. Para as partículas alfa, usou-se o Modelo Linear, obtendo-se o parâmetro α = 1:13 +- 0:02 Gy-2. O valor de RBE obtido, para uma fração de sobrevivência de 10%, para a radiação alfa emitida pela fonte de Amerício-241 foi de 2:27 +- 0:06. Este valor encontra-se longe de outros valores reportados por outras equipas, embora a comparação com estes não seja 100% correta, uma vez que o RBE depende não só da radiação escolhida, como da radiação de referência (no nosso caso foi fotões de Co-60, nos outros usou-se Raios-X ou Cs-137) e, ainda mais importante, a linha celular usada. Sentiram-se ainda alguns problemas experimentais que poderão ter afetado o resultado final, uma vez que não foi possível recolher dados suficientes para inferir valores estatisticamente válidos. Em conclusão, os objetivos iniciais desta tese não foram alcançados, mas o trabalho realizado abre portas para uma futura discussão de como analisar dados provenientes de um ensaio de focos, acentuando a importância de corretamente separar os dados obtidos, tentando ao máximo selecionar apenas os dados que são realmente relevantes para a análise. Relativamente ao segundo estudo, mantém-se ainda de grande interesse avaliar a resposta de células saudáveis da próstata aos protões, não só porque é importante registar a possível letalidade, como a falta de dados para esta linha celular pode tornar o tratamento perigoso.
This thesis addresses the study of the biological effects induced by ionising radiation, such as alphaparticles, photons and protons, in Human Umbilical Vein Endothelial cells (HUVEC) and normal (noncancerous) human epithelial prostate cells (RWPE-1). In the first part of the thesis, we aimed to obtain an estimative of the probability that different radiation qualities have in inducing DNA damage. HUVEC cells were exposed to 8, 10 and 20 MeV alphaparticles and 3 MeV protons in the microbeam facility at Physikalisch-Technische Bundesanstalt (PTB), Braunschweig, Germany, in a quincunx pattern (face-5 of a dice) so that each focus could be easily distinguished. For each radiation type, cells were imaged in a fluorescence microscope and the images of nuclei containing foci were analysed using the free software CellProfiler (CP) for identification and counting of nuclei and foci per nucleus. The data retrieved from CP can be seen as a convolution between radiation-induced foci and background foci (foci already present in the cells due to handling, stress or other biological factors) and, therefore, we modulated the data as D(k) = I(k) = B(k). The aim was to find I(k), a linear superposition of binomial distributions of parameter p, that would best fit our data, p being the probability that the chosen radiation induces DNA damage. After our first try, where we found that the background data was better represented by an exponential decay rather than a Poisson distribution (X2 Exp = 0:124 against X2 Poisson = 133526 in the Goodness of Fit Test, where a small values represents a good agreement between the data and the function) we noticed that our current function B(k) didn’t reproduce correctly our real data, which is important. We turned our focus to the background data and the cleaning process, in order to obtain a more realistic function. Besides the basic cleaning steps (remove artefacts, cells with a high number of foci, due to division, and cells close to the border of the image) we studied the influence, on the resulting frequency distribution, of parameters such as foci intensity and nuclei area. We started by applying a threshold on the foci intensity (meaning, that focus with an intensity below the threshold would be eliminated from our data) from 0 to 100 and found that when applying a threshold of 23 the agreement between the values given by the function and our data improved (X2 = 0:0070). The agreement gets even better (X2 = 0:0044) when we applied upper and lower thresholds for the nuclei area, with the best threshold being 7000 and 21000 pxl2 for lower and upper thresholds, respectively. Although our background function greatly improved, the fitting of the irradiated data was still not good, which shows that further improvements in the cleaning of the irradiated data is necessary before trying to fit the function. In the second part of the thesis we used RWPE-1 cells (non-cancerous human epithelial prostate cells). The prostate cancer is highly treated with radiotherapy and the radiation of choice is protons, so it is important to assess the impact of this radiation on the healthy cells. For this purpose, we planned a clonogenic assay where we would exposed RWPE-1 cells to Co-60 photons (reference radiation) and 3 MeV protons to assess the RBE value of the latter. However, due to experimental problems, that was not possible to do. Since RBE also depends on the cell line, we decided to evaluate the RBE value for Am-241 α-particles. The cells were exposed to 0.5, 1, 2, 4,6 and 10 Gy of photons and 0.25, 0.5, 1 and 2 Gy of α-particles. The resulting RBE value was of 2:27 +-0:06. This value was far from values reported by other teams around the world, although they used different cell lines and reference radiations.
This thesis addresses the study of the biological effects induced by ionising radiation, such as alphaparticles, photons and protons, in Human Umbilical Vein Endothelial cells (HUVEC) and normal (noncancerous) human epithelial prostate cells (RWPE-1). In the first part of the thesis, we aimed to obtain an estimative of the probability that different radiation qualities have in inducing DNA damage. HUVEC cells were exposed to 8, 10 and 20 MeV alphaparticles and 3 MeV protons in the microbeam facility at Physikalisch-Technische Bundesanstalt (PTB), Braunschweig, Germany, in a quincunx pattern (face-5 of a dice) so that each focus could be easily distinguished. For each radiation type, cells were imaged in a fluorescence microscope and the images of nuclei containing foci were analysed using the free software CellProfiler (CP) for identification and counting of nuclei and foci per nucleus. The data retrieved from CP can be seen as a convolution between radiation-induced foci and background foci (foci already present in the cells due to handling, stress or other biological factors) and, therefore, we modulated the data as D(k) = I(k) = B(k). The aim was to find I(k), a linear superposition of binomial distributions of parameter p, that would best fit our data, p being the probability that the chosen radiation induces DNA damage. After our first try, where we found that the background data was better represented by an exponential decay rather than a Poisson distribution (X2 Exp = 0:124 against X2 Poisson = 133526 in the Goodness of Fit Test, where a small values represents a good agreement between the data and the function) we noticed that our current function B(k) didn’t reproduce correctly our real data, which is important. We turned our focus to the background data and the cleaning process, in order to obtain a more realistic function. Besides the basic cleaning steps (remove artefacts, cells with a high number of foci, due to division, and cells close to the border of the image) we studied the influence, on the resulting frequency distribution, of parameters such as foci intensity and nuclei area. We started by applying a threshold on the foci intensity (meaning, that focus with an intensity below the threshold would be eliminated from our data) from 0 to 100 and found that when applying a threshold of 23 the agreement between the values given by the function and our data improved (X2 = 0:0070). The agreement gets even better (X2 = 0:0044) when we applied upper and lower thresholds for the nuclei area, with the best threshold being 7000 and 21000 pxl2 for lower and upper thresholds, respectively. Although our background function greatly improved, the fitting of the irradiated data was still not good, which shows that further improvements in the cleaning of the irradiated data is necessary before trying to fit the function. In the second part of the thesis we used RWPE-1 cells (non-cancerous human epithelial prostate cells). The prostate cancer is highly treated with radiotherapy and the radiation of choice is protons, so it is important to assess the impact of this radiation on the healthy cells. For this purpose, we planned a clonogenic assay where we would exposed RWPE-1 cells to Co-60 photons (reference radiation) and 3 MeV protons to assess the RBE value of the latter. However, due to experimental problems, that was not possible to do. Since RBE also depends on the cell line, we decided to evaluate the RBE value for Am-241 α-particles. The cells were exposed to 0.5, 1, 2, 4,6 and 10 Gy of photons and 0.25, 0.5, 1 and 2 Gy of α-particles. The resulting RBE value was of 2:27 +-0:06. This value was far from values reported by other teams around the world, although they used different cell lines and reference radiations.
Descrição
Tese de mestrado integrado em Engenharia Física, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, em 2018
Palavras-chave
Focos induzidos por radiação Ensaio clonogénico Radioterapia Dosimetria Estatística Teses de mestrado - 2018