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Probing the synaptic target of a new putative antiepileptic drug: modulation of the excitatory transmission in the hippocampus
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Resumo(s)
A complexidade do nosso sistema nervoso permite-nos apreciar momentos de reflexão, arte e imaginação, veiculada ou não pela linguagem. A unidade funcional que o permite é o neurónio, que dispara potenciais de acção seguidos de potenciais sinápticos que no conjunto são considerados a unidade básica de informação. O potencial de acção é um ponto central da regulação do sistema nervoso, que reflete não só a função de canais iónicos e outras estruturas que, ao nível subcelular, o modulam, mas também constitui a base da comunicação entre estruturas cerebrais e determina a coerência ou não de actividade neuronal. Os vários níveis de regulação do potencial de acção e do potencial sináptico interagem entre si e garantem o correcto controlo da excitabilidade. Contudo, dada essa flexível interacção, um pequeno desequilíbrio num dos níveis manifesta-se no sistema inteiro, como é o caso da epilepsia: uma mutação num canal de sódio dependente de voltagem, por exemplo, é suficiente para tornar o indivíduo susceptível a convulsões. Estas caracterizam-se por um desequilíbrio entre o tónus excitatório/inibitório que conduz a actividade neuronal anormal, excessiva e hipersíncrona no cérebro, tornando o indivíduo incapaz de conscientemente controlar o seu corpo por breves momentos, o que resulta frequentemente em fatalidades.
Actualmente, 30% dos pacientes com epilepsia não respondem aos antiepilépticos actuais, ou seja, é fármaco-resistente, o que acarreta 75% do fardo socioeconómico associado a esta doença neurológica. Os mecanismos que estão na base da resistência aos fármacos são partilhados por outras patologias e não estão necessariamente relacionados com os mecanismos de epileptogénese per se. Para ultrapassar esta barreira, uma estratégia a seguir consiste em estudar os mecanismos endógenos anticonvulsivantes do cérebro e potenciá-los, como é o caso da adenosina.
A adenosina é uma molécula ubíqua em todas as células do corpo humano, envolvida em processos básicos de suporte celular (como suporte estrutural nos ácidos nucleicos e suporte funcional na transferência de energia através de ATP). No sistema nervoso, é um importante neuromodulador que apresenta propriedades anticonvulsivantes, principalmente mediadas, mas não restringidas, ao receptor A1R da adenosina. Estes receptores são os mais abundantes, sendo expressos numa grande variedade de tecidos e órgãos, incluindo o sistema nervoso e o sistema cardiovascular. A activação dos receptores A1 tem um efeito anticonvulsivante ao diminuir a transmissão sináptica excitatória, diminuindo, assim, a probabilidade de actividade neuronal síncrona e excessiva. Os efeitos da activação dos receptores A1 manifestam-se pré- e pós sinapticamente. Pré-sinapticamente, a activação dos receptores A1 acoplados à proteína Gi/o resulta na diminuição de cálcio, necessário na libertação de vesículas de neurotransmissor. Assim, observa-se uma libertação de neurotransmissor assíncrona, responsável por um potencial excitatório pós-sináptico (EPSP) de menor amplitude. Pós-sinapticamente, a activação dos receptores A1 resulta na activação de canais de potássio, conduzindo à hiperpolarização do potencial de membrana. A redução da transmissão sináptica através dos receptores A1 deve-se, assim, à menor amplitude do potencial excitatório pós-sináptico, hiperpolarização do potencial de membrana e resistência da membrana diminuindo de modo global a transmissão sináptica.
A utilização de adenosina em modelos de epilepsia fármaco-resistente foi capaz de prevenir convulsões. Contudo, a presença dos receptores A1 no sistema periférico, nomeadamente no sistema cardiovascular, tornam a administração sistémica da adenosina impraticável, dados os severos efeitos secundários resultantes da depressão da actividade cardíaca. Uma alternativa seria o desenvolvimento de análogos da adenosina que fossem selectivos e de elevada afinidade para os receptores A1R do sistema nervoso central e não para o sistema periférico.
O fármaco MRS5474, desenvolvido pelo grupo de investigação do Prof. Keneth Jacobson, apresenta tais características, com um efeito anticonvulsivante num modelo de epilepsia fármaco-resistente (6Hz) quando administrado intraperitonealmente em ratinhos sem os típicos efeitos secundários periféricos observados por um agonista clássico selectivo dos receptores A1, CCPA.
O mecanismo de acção do MRS5474 é ainda desconhecido, mas o seu efeito in vivo parece apontar para selectividade para o sistema nervoso em vez do sistema periférico. Tal pode ocorrer se o MRS5474 actuar apenas sobre um alvo sináptico que apenas se encontra presente no sistema nervoso central.
Compreender o alvo sináptico e o mecanismo de acção do MRS5474 pode permitir a identificação de um novo alvo para o desenvolvimento de novos fármacos antiepilépticos. Neste trabalho, a hipótese testada foi a de que o MRS5474 diminui a transmissão sináptica excitatória nas células piramidais CA1 do hipocampo através de activação dos receptores A1. Esta estrutura é a mais implicada na epilepsia de lobo temporal, o tipo mais comum de epilepsia fármaco-resistente.
De modo a estudar a transmissão sináptica excitatória nas células piramidais CA1, utilizaram-se fatias agudas de hipocampo de ratos wistar wild-type (3-8 semanas). As fibras que estimulam as células piramidais CA1 (Colaterais de Schaffer ou Via Perforante) foram electricamente estimuladas e as correntes pós-sinápticas excitatórias (EPSC) geradas em células piramidais CA1 registadas pela técnica de patch-clamp, no modo whole cell. Para se isolar a componente excitatória da transmissão sináptica, bloqueou-se farmacologicamente os receptores ionotrópicos GABAA responsáveis pela componente inibitória rápida, adicionando ao meio de perfusão Picrotoxina (50 μM). Após se obter estabilidade no registo da amplitude de EPSP (durante pelo menos 10 minutos) os fármacos a testar foram adicionados ao meio de perfusão, CCPA (30 nM) ou MRS5474 (120 nM), a concentrações aproximadamente equipotentes para os receptores A1.
Em primeiro lugar, foi importante testar a activação dos receptores A1 com um agonista clássico selectivo (CCPA 30 nM), cujos efeitos estão amplamente descritos na literatura para obter um controlo experimental e metodológico. Observaram-se os efeitos esperados da activação dos receptores A1R: diminuição da amplitude das correntes pós-sinápticas excitatórias em 70 ± 5,2 % (n=4, p<0.001), diminuição da resistência membranar em 9,9±1,3% (n=4, p<0.05) e hiperpolarização do potencial de membrana estimado em 6,3±0,55 mV (n=3, p<001) a partir da medição de corrente injectada para manter o potencial de membrana constante a -70 mV.
Relativamente ao MRS5474, este não alterou significativamente a amplitude dos EPSPs (128 ± 12,3%, n=8, p>0.05), embora se tenha observado uma elevada tendência para disparo de potencial de acção, contaminando os EPSPs e destabilizando o registo. De modo a isolar-se os EPSPs dos potenciais de acção, utilizou-se um bloqueador de canais de sódio dependentes da voltagem, QX-314 (5 mM), o que reduziu a variabilidade do efeito do MRS5474 sobre os EPSPs mas não o alterou significativamente (100 ± 2,40%, n=5, p>0.05). Dada a tendência que as células piramidais CA1 apresentaram para disparar potenciais de acção na presença de MRS5474, o seu efeito na excitabilidade intrínseca foi testado através do registo de padrões de disparo. A mesma fatia foi usada para medir padrões de disparo de células piramidais CA1 antes e depois da exposição (>1 hora) ao MRS5474. De facto, a presença de MRS5474 (120 nM) aumentou excitabilidade nas células piramidais CA1, através de despolarização da membrana (6,1±1,5 mV, n=4 Control, n=8 MRS5474, p<0.01), aumento da frequência de disparo de potenciais de acção (157 ±11,8%, n=4 Control, n=8 MRS5474, p<0.01) e diminuição da amplitude das correntes rápida (fast) e média (médium) de hiperpolarização da fase de repolarização do potencial de acção (‘Afterhyperpolarization’ - AHP) fAHP (42±8,7%, n=4 Control, n=8 MRS5474, p<0.01) e mAHP (28±5,7%, n=4 Control, n=8 MRS5474, p<0.001) a frequência máxima.
Pode concluir-se que o MRS5474 (120 nM) facilita a excitabilidade das células piramidais CA1 no hipocampo, sem alterar as correntes sinápticas excitatórias, o que por si só não explica a sua acção anticonvulsivante in vivo. Pelo contrário, sugere um papel pro-excitatório do fármaco. Contudo, é necessário ter em conta que os resultados obtidos corresponderam às correntes excitatórias de células piramidais CA1 no hipocampo de ratos sem patologia. O efeito de MRS5474 (120 nM) na componente inibitória da transmissão sináptica das células piramidais CA1 assim como o seu efeito em interneurónios, células inibitórias, não foi ainda estudado. Contudo, é fundamental para se poder concluir acerca do mecanismo de acção do MRS5474 como anticonvulsivante, quer em condições depolarizantes (comuns durante convulsões) quer na excitabilidade de interneurónios.
Activation of adenosinergic system in epileptogenic conditions is an efficient endogenous anticonvulsivant mechanism that protects against pharmacoresistant epilepsy. However its systemic administration also triggers unacceptable side effects, mainly cardiovascular, that prevent its use as an antiepileptic drug (AED). A new adenosine derivative MRS5474 was shown to protect against elicited seizures in vivo in a pharmacoresistant epilepsy model without significant side effects, unlike the classical selective A1R agonist CCPA. In this work, we aimed at determining the synaptic target of MRS5474 which may help shift the search for new AED towards a novel target. According to binding and adenylate cyclase activity studies, MRS5474 has high A1R affinity and full agonism with moderate selectivity against other adenosine receptors (e.g. A3R). We thus hypothesized that MRS5474 decreases excitatory synaptic transmission in CA1 pyramidal cells of the rat hippocampus through A1R activation. Acute hippocampal slices from wild-type Wistar rats (3–8 weeks) were used to record excitatory postsynaptic currents (EPSCs) and action potentials (AP) (whole-cell patch clamp) from pyramidal neurons of the CA1 area. Upon electrical stimulation of Schaffer Collaterals, EPSCs were recorded from pyramidal cells under voltage clamp at a Vh of -70 mV. To study MRS5474 (120 nM) effect on excitability properties of the studied cells, action potentials were measured under current clamp after at least 1h exposition to MRS5474. The effect of MRS5474 (120 nM) was compared with that of a standard A1R agonist, CCPA (30 nM), at an equipotent concentration for the A1R. The results show that CCPA (30 nM) had a typical A1R activation effects: inhibition of excitatory synaptic transmission by decreased EPSC amplitude and membrane potential hyperpolarization, both effects being prevented in the presence of an A1R antagonist (DPCPX, 100 nM). Unlike CCPA, MRS5474 (120 nM) did not behave as a classical A1R agonist, since it had no inhibitory effect on excitatory synaptic transmission and even presented a pro-excitatory effect on CA1 pyramidal cell intrinsic excitability properties: resting membrane potential depolarization, increased firing frequency and altered afterhyperpolarization (AHP) current components (decreased fast and medium AHP and increased slow AHP). So far, a pro-excitatory role of MRS5474 on excitatory synaptic transmission on CA1 pyramidal cells of healthy rat hippocampus is not able to explain the MRS5474 anticonvulsivant properties in vivo in a model of pharmacoresistant epilepsy (6 Hz). If the increased intrinsic excitability caused by MRS5474 on CA1 pyramidal cells is also observed at a slight greater extent in interneurons, then the global net effect of MRS5474 would be inhibitory. This hypothesis could explain not only its anticonvulsivant properties but also the lack of observable side effects. Further studies evaluating the influence of this drug under more depolarizing conditions (often occurring during seizures) and in the excitability of inhibitory neurons are required to understand the antiepileptic mechanism operated by this drug. Being able to bypass the negative implications of using the adenosinergic system and take advantage of its powerful anticonvulsivant properties is a promising track to fight pharmacoresistant epilepsy.
Activation of adenosinergic system in epileptogenic conditions is an efficient endogenous anticonvulsivant mechanism that protects against pharmacoresistant epilepsy. However its systemic administration also triggers unacceptable side effects, mainly cardiovascular, that prevent its use as an antiepileptic drug (AED). A new adenosine derivative MRS5474 was shown to protect against elicited seizures in vivo in a pharmacoresistant epilepsy model without significant side effects, unlike the classical selective A1R agonist CCPA. In this work, we aimed at determining the synaptic target of MRS5474 which may help shift the search for new AED towards a novel target. According to binding and adenylate cyclase activity studies, MRS5474 has high A1R affinity and full agonism with moderate selectivity against other adenosine receptors (e.g. A3R). We thus hypothesized that MRS5474 decreases excitatory synaptic transmission in CA1 pyramidal cells of the rat hippocampus through A1R activation. Acute hippocampal slices from wild-type Wistar rats (3–8 weeks) were used to record excitatory postsynaptic currents (EPSCs) and action potentials (AP) (whole-cell patch clamp) from pyramidal neurons of the CA1 area. Upon electrical stimulation of Schaffer Collaterals, EPSCs were recorded from pyramidal cells under voltage clamp at a Vh of -70 mV. To study MRS5474 (120 nM) effect on excitability properties of the studied cells, action potentials were measured under current clamp after at least 1h exposition to MRS5474. The effect of MRS5474 (120 nM) was compared with that of a standard A1R agonist, CCPA (30 nM), at an equipotent concentration for the A1R. The results show that CCPA (30 nM) had a typical A1R activation effects: inhibition of excitatory synaptic transmission by decreased EPSC amplitude and membrane potential hyperpolarization, both effects being prevented in the presence of an A1R antagonist (DPCPX, 100 nM). Unlike CCPA, MRS5474 (120 nM) did not behave as a classical A1R agonist, since it had no inhibitory effect on excitatory synaptic transmission and even presented a pro-excitatory effect on CA1 pyramidal cell intrinsic excitability properties: resting membrane potential depolarization, increased firing frequency and altered afterhyperpolarization (AHP) current components (decreased fast and medium AHP and increased slow AHP). So far, a pro-excitatory role of MRS5474 on excitatory synaptic transmission on CA1 pyramidal cells of healthy rat hippocampus is not able to explain the MRS5474 anticonvulsivant properties in vivo in a model of pharmacoresistant epilepsy (6 Hz). If the increased intrinsic excitability caused by MRS5474 on CA1 pyramidal cells is also observed at a slight greater extent in interneurons, then the global net effect of MRS5474 would be inhibitory. This hypothesis could explain not only its anticonvulsivant properties but also the lack of observable side effects. Further studies evaluating the influence of this drug under more depolarizing conditions (often occurring during seizures) and in the excitability of inhibitory neurons are required to understand the antiepileptic mechanism operated by this drug. Being able to bypass the negative implications of using the adenosinergic system and take advantage of its powerful anticonvulsivant properties is a promising track to fight pharmacoresistant epilepsy.
Descrição
Tese de mestrado em Bioquímica, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2016
Palavras-chave
Epilepsia farmacoresistente Adenosina Receptores A1 para adenosina MRS5474 CCPA Teses de mestrado - 2016