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Publicação
Screening of necroptosis modulators with potential therapeutic application
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Programmed cell death is a cellular death process in which a cell is eliminated in response to an inherent and genetically defined set of molecular events. In contrast, non-programmed cell death or classical necrosis is distinguished by its non-physiological or pathological triggering, coupled with lack of requirement for specific internal cellular signaling pathways. For a long time, apoptosis was considered as the sole form of programmed cell death. However, recent evidence suggests that necrosis can also be highly regulated, incorporating features of both necrosis and apoptosis in a process also referred to as necroptosis or programmed necrosis.
The establishment of necroptosis as an alternative form of regulated cell death resulted in the publication of several studies implicating it as the main contributor in the etiology and/or progression of human diseases, such as pancreatitis, ischemic injury and neurodegenerative diseases, among others. Additionally, accumulating evidence indicates that necroptosis is involved in the regulation of cancer. In fact, it is widely accepted that evasion of cell death is one of the hallmarks of cancer. Many lines of clinical and experimental evidence have demonstrated that failure in apoptosis is the most frequent cause of therapeutic resistance; thus, exploring other mechanisms of cancer cell death might lead to the development of strategies to overcome therapeutic resistance.
Ongoing progress in translational research in necroptosis has highlighted the increasing need for the identification of biomarkers of diagnosis, monitoring, and drug development. In addition, only a few small molecules, inhibiting molecular mediators of necroptosis, like Necrostatin-1, have been described. However, and thus far, no inhibitors of necroptosis are available for clinical use.
Targeting regulated necrosis may provide an unprecedented opportunity to develop novel therapeutic strategies. Screening assays of compound libraries will explore biological pathways that can be targeted with small molecules. The subsequent identification of target proteins of newly discovered hits is crucial to understand the cellular mechanism by which the small molecule acts. This project focused on the identification and characterization of novel modulators of necroptosis, which may ultimately translate into therapeutic strategies for the treatment of diseases associated with deregulated levels of necroptosis.
In order to identify novel modulators of necroptosis, we performed a biological screening using a library of twenty-one small molecules and identified three compounds with the ability to inhibit TNF-α-induced L929 cells necroptosis by more than 80%. To further characterize the activities of selected compounds, the half maximal effective concentration (EC50) for inhibiting necroptosis and the half maximal inhibitory concentration (IC50) for assessing drug toxicity were determined in the same cell model. Our results show that the selected hits inhibit necroptosis in L929 cells at micromolar EC50 concentrations and were not cytotoxic at the chosen range of concentrations. In addition, the mechanisms by which the hits inhibit necroptosis appear to involve, at least in part, inhibition of necroptosis signaling proteins RIP1 and MLKL.
In parallel, we evaluated the ability of different bile acids, well-established modulators of apoptosis, in inhibiting necroptosis. Six bile acids and four newly synthesized derivatives were studied; one molecule inhibited TNF-α-induced necroptosis by more than 60% in L929 cells
In conclusion, the work presented here describes the discovery of four potential inhibitors of necroptosis, their confirmation/validation and possible mechanism(s) of action. A better understanding of the mechanisms of action of these compounds, as well as the study of their pharmacokinetic properties should help to determine their potential utility in disease treatment.
A morte celular programada é um processo através do qual uma célula é eliminada em resposta a um conjunto de eventos moleculares bem definidos. Por outro lado, a morte celular não programada, ou necrose clássica, distingue-se por ser provocada de forma não fisiológica ou patológica, não necessitando de maquinaria celular interna específica. Durante muito tempo, a apoptose foi considerada como a única forma de morte celular programada. Contudo, estudos recentes sugerem que a necrose pode ser altamente regulada, num processo designado por necroptose, a qual incorpora aspetos característicos da necrose e da apoptose. Após o estabelecimento da necroptose como uma forma alternativa de morte celular, alguns estudos já a evidenciaram como o principal contribuinte na etiologia e/ou progressão de doenças humanas, nomeadamente, em pancreatite, doença isquémica e doenças neurodegenerativas, entre outras. Adicionalmente, a necroptose está envolvida na regulação do cancro. Em particular, a evasão da morte celular é considerada uma das principais características do cancro e diversos estudos clínicos e experimentais têm demonstrado que defeitos na apoptose das células cancerígenas são das causas mais frequentes de resistência à terapêutica. Assim, a investigação de outros mecanismos de morte das células cancerígenas poderá permitir o desenvolvimento de estratégias que visem ultrapassar esta resistência. O progresso contínuo na investigação da necroptose realçou a necessidade, cada vez maior, de identificar biomarcadores para utilização em diagnóstico, monitorização e desenvolvimento de fármacos. Já foram descritos compostos que inibem elementos da via de sinalização da morte celular por necroptose, como a Necrostatina-1; contudo, ainda não estão disponíveis inibidores da necroptose na prática clínica. Estratégias que tenham como alvo a necroptose constituem oportunidades únicas para desenvolver novas terapias para o tratamento das doenças anteriormente referidas. Os ensaios de screening de bibliotecas de compostos permitem identificar e, posteriormente, explorar vias biológicas que podem ser atingidas por pequenas moléculas, nomeadamente a via da necroptose. A subsequente identificação das proteínas-alvo dos compostos bioativos é crucial, uma vez que esta interação é a chave para compreender o mecanismo de ação dos mesmos. Deste modo, este projeto teve como objetivo a identificação e caracterização de novos moduladores da necroptose, os quais podem posteriormente traduzir-se em novas estratégias terapêuticas para o tratamento de patologias que resultem de níveis desregulados de necroptose. De modo a identificar novos moduladores da necroptose, realizou-se um screening com uma biblioteca de vinte e uma pequenas moléculas e identificaram-se três compostos com capacidade de inibir a necroptose induzida pelo TNF-α em células L929, em mais de 80%. Para caracterizar as atividades dos compostos selecionados, determinaram-se os seus EC50 (half maximal effective concentration) e IC50 (half maximal inhibitory concentration) no mesmo modelo celular. Os resultados indicaram que os hits selecionados bloqueiam a necroptose a concentrações na ordem dos micromolar, não apresentando citotoxicidade no intervalo de concentrações utilizado. Além disso, o mecanismo pelo qual os hits inibem a necroptose parece envolver, pelo menos em parte, a inibição das proteínas de sinalização RIP1 e MLKL. Em paralelo, testou-se a capacidade de diferentes ácidos biliares, moduladores estabelecidos da apoptose, em inibir a via da necroptose. Foram estudados seis ácidos biliares e quatro derivados; um mostrou ser capaz de inibir a necroptose induzida pelo TNF-α em células L929, em mais de 60%. Em suma, o trabalho apresentado descreve a descoberta de quatro potenciais inibidores da necroptose, a sua confirmação/validação e possível mecanismo de ação. Uma maior compreensão dos mecanismos de ação destes compostos, assim como o estudo das suas propriedades farmacocinéticas irá ajudar a determinar a sua utilidade na clínica.
A morte celular programada é um processo através do qual uma célula é eliminada em resposta a um conjunto de eventos moleculares bem definidos. Por outro lado, a morte celular não programada, ou necrose clássica, distingue-se por ser provocada de forma não fisiológica ou patológica, não necessitando de maquinaria celular interna específica. Durante muito tempo, a apoptose foi considerada como a única forma de morte celular programada. Contudo, estudos recentes sugerem que a necrose pode ser altamente regulada, num processo designado por necroptose, a qual incorpora aspetos característicos da necrose e da apoptose. Após o estabelecimento da necroptose como uma forma alternativa de morte celular, alguns estudos já a evidenciaram como o principal contribuinte na etiologia e/ou progressão de doenças humanas, nomeadamente, em pancreatite, doença isquémica e doenças neurodegenerativas, entre outras. Adicionalmente, a necroptose está envolvida na regulação do cancro. Em particular, a evasão da morte celular é considerada uma das principais características do cancro e diversos estudos clínicos e experimentais têm demonstrado que defeitos na apoptose das células cancerígenas são das causas mais frequentes de resistência à terapêutica. Assim, a investigação de outros mecanismos de morte das células cancerígenas poderá permitir o desenvolvimento de estratégias que visem ultrapassar esta resistência. O progresso contínuo na investigação da necroptose realçou a necessidade, cada vez maior, de identificar biomarcadores para utilização em diagnóstico, monitorização e desenvolvimento de fármacos. Já foram descritos compostos que inibem elementos da via de sinalização da morte celular por necroptose, como a Necrostatina-1; contudo, ainda não estão disponíveis inibidores da necroptose na prática clínica. Estratégias que tenham como alvo a necroptose constituem oportunidades únicas para desenvolver novas terapias para o tratamento das doenças anteriormente referidas. Os ensaios de screening de bibliotecas de compostos permitem identificar e, posteriormente, explorar vias biológicas que podem ser atingidas por pequenas moléculas, nomeadamente a via da necroptose. A subsequente identificação das proteínas-alvo dos compostos bioativos é crucial, uma vez que esta interação é a chave para compreender o mecanismo de ação dos mesmos. Deste modo, este projeto teve como objetivo a identificação e caracterização de novos moduladores da necroptose, os quais podem posteriormente traduzir-se em novas estratégias terapêuticas para o tratamento de patologias que resultem de níveis desregulados de necroptose. De modo a identificar novos moduladores da necroptose, realizou-se um screening com uma biblioteca de vinte e uma pequenas moléculas e identificaram-se três compostos com capacidade de inibir a necroptose induzida pelo TNF-α em células L929, em mais de 80%. Para caracterizar as atividades dos compostos selecionados, determinaram-se os seus EC50 (half maximal effective concentration) e IC50 (half maximal inhibitory concentration) no mesmo modelo celular. Os resultados indicaram que os hits selecionados bloqueiam a necroptose a concentrações na ordem dos micromolar, não apresentando citotoxicidade no intervalo de concentrações utilizado. Além disso, o mecanismo pelo qual os hits inibem a necroptose parece envolver, pelo menos em parte, a inibição das proteínas de sinalização RIP1 e MLKL. Em paralelo, testou-se a capacidade de diferentes ácidos biliares, moduladores estabelecidos da apoptose, em inibir a via da necroptose. Foram estudados seis ácidos biliares e quatro derivados; um mostrou ser capaz de inibir a necroptose induzida pelo TNF-α em células L929, em mais de 60%. Em suma, o trabalho apresentado descreve a descoberta de quatro potenciais inibidores da necroptose, a sua confirmação/validação e possível mecanismo de ação. Uma maior compreensão dos mecanismos de ação destes compostos, assim como o estudo das suas propriedades farmacocinéticas irá ajudar a determinar a sua utilidade na clínica.
Descrição
Tese de mestrado, Ciências Biofarmacêuticas, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2016
Palavras-chave
Bile acids MLKL Necroptosis RIP1 Screening Small molecules Teses de mestrado - 2016