Toxic protein aggregation in neurodegeneration

Funder

Organizational Unit

Publications

Characterization of a novel mouse model for neurodegeneration

Publication . Padilha, Miguel da Silva; Sebastião, Ana Maria Ferreira de Sousa; Dudanova, Irina

Doenças neurodegenerativas são enfermidades devastadoras, responsáveis pela perda de células do sistema nervoso central. Este grupo de doenças crónicas e progressivas que afetam competências cognitivas e motoras têm vindo a tornar-se cada vez mais predominantes, afetando a capacidade das pessoas em atender às suas necessidades básicas e, finalmente, resultando na sua morte. Os efeitos debilitantes e letais destes distúrbios realçam a necessidade de tratamentos eficazes, no entanto, até ao momento nenhuma cura se encontra disponível. Ao longo das últimas décadas, foi estabelecido que o misfolding, agregação e acumulação de proteínas ricas em estrutura beta, semelhantes a amiloides, são os eventos críticos comuns às doenças neurodegenerativas. Como consequência da sua conformação patológica, estes agregados semelhantes a amiloides exercem efeitos tóxicos denominados de efeitos de ganho de função tóxica. Apesar desse conhecimento, os complexos mecanismos moleculares que ligam estes eventos à morte celular e à neurodegeneração permanecem maioritariamente desconhecidos. Por essa razão, os objetivos desta tese consistiram em estudar os efeitos do ganho de função tóxica induzido pela agregação. Para garantir o sucesso na prossecução destes objetivos, durante o trabalho desenvolvido nesta tese, nós utilizámos uma proteína artificial, sem qualquer função biológica, que foi criada de modo a formar estruturas ricas em folhas beta, denominada β23. Adicionalmente, o trabalho experimental foi dividido em duas secções: i) caracterização histológica e comportamental de um novo modelo induzível de rato transgénico; ii) análise in vitro dos efeitos de β23 na viabilidade celular e no transporte núcleo-citoplasmático. De forma a estudar os efeitos da agregação de proteínas ricas em folhas-β, foi gerada uma linha de ratos transgénicos, a partir do cruzamento de duas linhas transgénicas já existentes, a linha TRE3G:mycβ23-FRT-IRES-FRT-mCherry e a linha NEFH:tTa. A primeira linha tinha já sido criada no nosso laboratório e consiste numa sequência de β23 ligada ao marcador myc e separada da sequência da proteína fluorescente mCherry por uma sequência IRES. Por sua vez, esta sequência IRES encontra-se flanqueada por duas sequências de reconhecimento de flipase. A transcrição deste construct encontrava-se depois sob o controlo de um promotor sensível a tetraciclina, o que tornou possível regular a transcrição dos genes a jusante do promotor. Como foi utilizado um promotor Tet-off, o promotor encontrava-se sempre ativo, exceto na presença de tetraciclina ou um dos seus análogos. No entanto, estes ratos transgénicos não expressavam os genes sob o controlo do promotor, uma vez que para isso acontecer ativadores transcricionais de tetraciclina (tTa) precisavam de se ligar ao promotor. Para promover a expressão de β23, esta linha transgénica foi cruzada com uma outra linha, a NEFH:tTa. Nesta segunda linha, tTa era expresso em neurónios, sob o controlo do promotor do gene que codifica para a proteína da cadeia pesada de neurofilamentos. Desta forma, ratos transgénicos resultantes do cruzamento destas duas linhas que possuíam ambos transgenes, denominados ratos duplo-transgénicos, expressavam a proteína β23 no sistema nervoso central. Ratos que só possuíam um dos transgenes (ratos transgénicos), ou ratos não transgénicos, não expressavam a proteína β23. Desta forma, ratos transgénicos e ratos não transgénicos foram utilizados como controlos. Surpreendentemente, antes de começar a caracterização, foi descoberto que ratos duplo-transgénicos que expressavam β23 estavam a morrer antes de nascer. De forma a contornar este resultado e proceder com a caracterização, foi inibida a expressão de β23 durante o desenvolvimento embrionário, através da administração de doxiciclina (análogo da tetraciclina) aos progenitores, a partir do momento em que estes foram colocados juntos. Após o nascimento dos ratos, o tratamento de doxiciclina era continuado até estes atingirem as 3 semanas de idade. A morte perinatal de ratos que expressavam β23 indicava que o ganho de função tóxica induzido pela agregação desempenhava uma função crucial na indução da letalidade embrionária. Após terem sido obtidos ratos viáveis, começámos por confirmar que β23 era expressa especificamente no sistema nervoso central dos ratos duplo-transgénicos, mas não em ratos que só possuíssem um dos transgenes ou em ratos não transgénicos. β23 começou a ser expressa entre as 7 e as 12 semanas de idade (4 a 9 semanas depois de ser retirada a doxiciclina) e enquanto que no cérebro de ratos com 12 semanas de idade, a expressão de β23 estava confinada ao córtex, na medula espinhal de ratos com a mesma idade esta expressão aparentava ser muito mais generalizada. A expressão de β23 deu origem à formação de agregados citoplasmáticos, neuríticos e, em particular, perinucleares. A presença destes agregados em torno da membrana nuclear foram sugestivos de que interferências com o transporte núcleo-citoplasmático poderiam estar envolvidas na citotoxicidade induzida pela agregação. De forma a averiguar se a expressão de β23 tinha algum impacto a nível do sistema nervoso central, foram analisados os cérebros e as medulas espinhais de ratos duplo-transgénicos e dos controlos transgénicos e não transgénicos. A nível macroscópico foi detetado que os cérebros dos ratos duplo-transgénicos eram mais leves, e consequentemente menores, que os cérebros dos controlos. No entanto, a nível microscópico não foram encontradas diferenças no número de neurónios maturos numa das regiões do córtex na qual foi detetada expressão de β23, entre os duplo-transgénicos e controlos. Nas medulas espinhais, foi observado que ratos duplo-transgénicos tinham menos neurónios motores nos cornos ventrais de secções cervicais e lombares, quando comparados com os controlos. De seguida, foi investigado se a expressão β23 e as alterações estruturais observadas tinham algum impacto comportamental. Para tal, foram avaliadas três componentes motoras (força dos membros, coordenação motora e locomoção) e duas componentes sensoriais (perceção sensorial leve e nocicepção) às 12 e 24 semanas de idade. Às 12 semanas de idade, os ratos duplo-transgénicos só tiveram um desempenho significativamente pior que os controlos em um dos testes de força. No entanto, a condição motora deteriorou-se ao longo do tempo e às 24 semanas de idade, os ratos duplo-transgénicos tiveram um desempenho significativamente inferior em testes das três componentes motoras, quando comparados com os controlos. A nível sensorial, embora tenha sido detetada uma tendência que se manteve ao logo do tempo para os duplo-transgénicos terem uma pior performance nos testes de perceção sensorial leve, quando comparados com a performance dos controlos, as diferenças observadas não foram significativas. Nos testes de nocicepção não foi detetada qualquer diferença entre os grupos de ratos, quer às 12 ou às 24 semanas de idade. Assim, expressão de β23 no sistema nervoso central dos ratos duplo-transgénicos deu origem ao desenvolvimento de um fenótipo motor progressivo. Por último, de modo a avaliar se lesões no transporte núcleo-citoplasmático estavam envolvidas na morte neuronal, foram investigados os efeitos das proteínas em folha beta na viabilidade neuronal, na importação núcleo-citoplasmática e na exportação núcleo-citoplasmática, em neurónios de rato em cultura. Embora não tenham sido encontradas diferenças na importação núcleo-citoplasmática, foi detetada uma correlação entre o declínio temporal da exportação núcleo-citoplasmática e o declínio temporal da viabilidade celular. De acordo com os dados obtidos, danos na maquinaria do transporte núcleo-citoplasmático pode ser um dos mecanismos através do qual agregados proteicos exercem uma função tóxica. Concluindo, os nossos resultados sugerem que o ganho de função tóxica, induzido pela agregação de proteínas, é suficiente para afetar processos essenciais para a viabilidade da célula e levar ao desenvolvimento de um fenótipo motor. Adicionalmente, estes resultados corroboram o uso de proteínas artificiais como um recurso poderoso no estudo do ganho de função tóxica e, possivelmente, como uma ferramenta importante para o desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas para combater a neurodegeneração.

2020-06-30Master thesis

Open access