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Characterization of variant forms of Medium-Chain Acyl-CoA Dehydrogenase (MCAD): towards the design of mutant- specific pharmacological approaches to the treatment of MCAD deficiency
Publication . Anselmo, Carolina Maria Batista; Leandro, Ana Paula Costa dos Santos Peralta; Ventura, Fatima
Os ácidos gordos são uma importante fonte de energia para o organismo e por isso a célula apresenta vias metabólicas específicas para a sua metabolização, nomeadamente através da via da β-oxidação mitocondrial dos ácidos gordos (mFAO). Alterações na mFAO e na cadeia respiratória mitocondrial podem apresentar uma causa genética, sendo assim classificadas como doenças hereditárias do metabolismo.
As alterações da mFAO podem causar doenças graves com variadas manifestações clínicas, principalmente relacionadas com o comprometimento metabólico do tecido músculo- esquelético e de órgãos como o fígado e coração. As doenças hereditárias da via da β-oxidação mitocondrial dos ácidos gordos são doenças autossómicas recessivas que incluem cerca de 20 doenças diferentes, e que afetam esta via nos seus diferentes passos, desde o transporte de ácidos gordos no citoplasma até à sua β-oxidação mitocondrial final. Os doentes com alterações hereditárias da mFAO geralmente apresentam intolerância ao jejum. A doença pode ser fatal, uma vez que os ácidos gordos são nutrientes importantes que ajudam o organismo a suportar longos períodos de jejum, fornecendo energia quando a glicose não está disponível e o glicogénio se esgota. Este aspeto é particularmente relevante para o tecido cardíaco uma vez que o coração depende principalmente da mFAO para produção de energia sendo que a privação desta fonte de energia contribui para o desenvolvimento de cardiomiopatia metabólica.
Cada ciclo da β-oxidação envolve quatro reações químicas diferentes, exigindo assim quatro tipos diferentes de enzimas. O primeiro passo do ciclo é responsável pela desidrogenação dos acil-CoAs a qual é promovida pela família das acil-CoA desidrogenases (ACADs) e que engloba as desidrogenases de acil-CoAs de cadeia curta (SCAD), cadeia média (MCAD) e cadeia muito longa (VLCAD). Estas enzimas apresentam uma especificidade para o número de átomos de carbono da cadeia hidrocarbonada, sendo que a MCAD é ativa para os acil-CoAs de cadeia média (C6 a C12).
A deficiência em desidrogenase de acil-CoA de cadeia média (MCADD), foi identificada pela primeira vez em 1976, e constitui a doença hereditária mais comum da mFAO. A MCADD é causada por mutações no gene ACADM, localizado no cromossoma 1p31, constituído por 12 exões e com 44.2 kb. Esta deficiência é mais comum na população Caucasiana do noroeste da Europa. Os doentes com MCADD apresentam níveis elevados de acilcarnitinas de cadeia média (C6 a C10), particularmente octanoil carnitina (C8) pela dificuldade em catabolizar os ácidos gordos de cadeia média. A acumulação de derivados da carnitina pode comprometer a homeostasia mitocondrial, havendo evidências de que alteram o metabolismo energético por inibição do transporte de eletrões na cadeia respiratória (complexos I-III, II-III e IV), da creatina cinase mitocondrial e Na+, K+ e ATPase sináptica no cérebro.
A MCAD tem um papel importante no metabolismo energético não só porque contribui para a pool de acetil-CoA que alimenta o ciclo de Krebs mas também porque no processo de desidrogenação dos acil-CoAs há formação de FADH2 o qual transfere os seus eletrões indiretamente à cadeia respiratória. Neste processo é fundamental o papel da flavo-proteína de transferência de eletrões (ETF). Esta proteína aceita eletrões de um conjunto diferente de flavo- enzimas envolvidas em várias vias mitocondriais não só na β-oxidação de ácidos gordos, mas também na degradação de aminoácidos. De facto, a ETF é uma proteína aceitadora, de pelo menos 9 desidrogenases diferentes, transferindo os equivalentes redutores obtidos nas reações de desidrogenação para a ETF-ubiquinona oxidorredutase (ETF-QO), que por sua vez fornece os equivalentes redutores à cadeia respiratória. Assim, numa situação normal a MCAD deverá interagir com a ETF, de modo a fazer a passagem de eletrões para a cadeia respiratória.
Os doentes com MCADD podem apresentar crises metabólicas recorrentes e que incluem hipoglicémia hipocetótica com letargia, devido ao esgotamento das reservas de glicogénio. Esta patologia apresenta uma alta taxa de mortalidade, especialmente na infância. No entanto, os doentes podem ser assintomáticos até a primeira crise metabólica, que pode ocorrer apenas na idade adulta.
A MCADD é uma das doenças hereditárias do metabolismo diagnosticada nos programas de rastreio neonatal (NBS) em vários países, incluindo Portugal. O diagnóstico é efetuado pela quantificação de acilcarnitinas, em amostras de sangue colhidas no calcanhar dos recém- nascidos (“teste do pezinho”), por espectrometria de massa em tandem (MS/MS). Atualmente o único tratamento consiste em evitar longos períodos de jejum e nalguns casos uma suplementação em carnitina para aumentar a desintoxicação dos metabolitos de ácidos gordos acumulados no organismo. Por essa razão, é crucial desenvolver terapias farmacológicas.
Uma vez que a MCADD é presentemente classificada como uma doença conformacional por perda-de-função, a utilização de pequenas moléculas capazes de estabilizar as variantes de MCAD conformacionalmente alteradas (misfolded), atuando como chaperones farmacológicos, seria uma opção terapêutica viável. Contudo, para identificar e desenvolver tais moléculas, o mecanismo molecular patogénico das variantes de hMCAD deve ser primeiro identificado, caracterizado e entendido. Nesta perspetiva, este trabalho teve como objetivo compreender os mecanismos moleculares patogénicos de 12 variantes de hMCAD causadas por mutações missense no gene ACADM.
Para atingir este objetivo as 12 variantes hMCAD e a forma selvagem (WT), foram produzidas num sistema de expressão procariota e posteriormente purificadas por cromatografia de afinidade com iões imobilizados (IMAC) sendo as formas homotetraméricas biologicamente ativas futuramente isoladas por cromatografia de exclusão molecular. As proteínas recombinantes obtidas foram caracterizadas a nível funcional e estrutural. A caracterização funcional incluiu não só a determinação da atividade enzimática, recorrendo ao par redox artificial PMS/DCPIP (metassulfato de fenazina/ 2,6-diclorofenolindofenol) onde o PMS funciona como aceitador intermediário e o DCPIP o aceitador final; como também a determinação da atividade enzimática utilizando a molécula natural (ETF) como aceitador intermediário (ETF/DCPIP). Para efetuar este ensaio, neste trabalho procedeu-se também ao desenvolvimento e otimização da produção e purificação da proteína ETF. Foi assim possível compreender se as variantes proteicas em estudo interagiam funcionalmente com a ETF. Estudou-se também o perfil da inativação térmica enzimática das proteínas alvo, uma vez que os perfis de inativação térmica estão fortemente correlacionados com alterações de conformação da proteína (agregação, dissociação em subunidades e desnaturação). Para abordar a estabilidade estrutural/conformacional, realizaram-se vários ensaios e que incluíram a avaliação do perfil de oligomerização, uma vez que o misfolding proteico origina frequentemente alterações na sua estrutura quaternária provocando mudanças no equilíbrio das formas oligoméricas (tetrâmeros, dímeros e monómeros) contribuindo para uma maior tendência para a agregação e consequente perda de funcionalidade. Efetuaram-se ainda ensaios de proteólise limitada por tripsina para avaliar possíveis alterações da estrutura terciária. Para monitorizar a estabilidade térmica da conformação proteica utilizou-se a fluorimetria diferencial de varrimento (DSF), método que foi ainda utilizado para determinar a constante aparente de ligação do FAD. De modo a obter uma melhor compreensão a nível da reorganização espacial das substituições de aminoácidos e do impacto nas interações com o FAD, substrato e hETF realizaram-se ensaios in silico recorrendo ao software UCFS Chimera.
No seu conjunto, os resultados obtidos suportam a hipótese de que nas variantes hMCAD estudadas as substituições de aminoácidos têm um forte impacto na conformação proteica resultando numa perda de função enzimática. Quer a nível estrutural, quer funcional as variantes que demonstram ser particularmente instáveis e propensas a alterações conformacionais acentuadas encontram-se distribuídas pelos três domínios proteicos e incluem as variantes p.Y48C e p.A140T no domínio N-terminal -helicoidal, a variante p.D143V no domínio central folha-β e a variante p.Y372N no domínio C-terminal α-helicoidal. Estas proteínas apresentam dificuldade na incorporação do FAD na sua estrutura, um elemento crucial para o seu folding mitocondrial, oligomerização adequada e atividade enzimática. Este poderá ser um dos fatores da sua instabilidade, quer a nível estrutural quer funcional.
Em suma, todas as variantes hMCAD analisadas neste estudo, mostraram alterações a nível bioquímico e estrutural, embora com diferentes graus de gravidade que, em última análise, poderão conduzir a uma degradação precoce no contexto biológico. A recuperação da conformação proteica pode ser potencialmente conseguida através da utilização de chaperones farmacológicos, particularmente para as variantes que mostraram maior instabilidade estrutural.
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Fundação para a Ciência e a Tecnologia
Programa de financiamento
3599-PPCDT
Número da atribuição
PTDC/BIA-BQM/29570/2017