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Characterizing the regulation of the CFTR protein by the kinase GRK5 in cystic fibrosis models

Publication . Caleiro, Mariana Ferreira; Botelho, Hugo Miguel Raposo Correia

A fibrose quística (FQ) é uma doença genética rara que afeta cerca de 160.000 pessoas em todo o mundo e cuja esperança média de vida ronda os 50 anos nos países desenvolvidos graças ao diagnóstico precoce e à disponibilidade de fármacos inovadores e eficazes. Esta doença afeta múltiplos órgãos, tais como as vias aéreas, os intestinos, o pâncreas, o fígado, e é causada pela herança de variantes patogénicas do gene do regulador de condutância transmembranar da fibrose quística (CFTR) em ambos os alelos. O gene CFTR codifica uma proteína com o mesmo nome e cuja função é conduzir iões cloreto (Cl- ) e bicarbonato (HCO3 - ) através da membrana plasmática (MP) das células epiteliais. A CFTR é um canal transmembranar composto por cinco domínios: dois domínios transmembranares (MSD1 e MSD2), dois domínios citosólicos de ligação de nucleótidos (NBD1 e NBD2) comuns entre os transportadores ATP-binding cassete (ABC), e um domínio regulador adicional (RD). Cada MSD é composto por 6 segmentos (TM1–TM6 e TM7–TM12) e forma o poro do canal que permite o fluxo transmembranar de Cle HCO3 - . NBD1 e NBD2 são essenciais para a regulação da CFTR, pois a sua dimerização dependente de adenosina trifosfato (ATP) é necessária à abertura (gating) do canal. Por fim, o RD consiste em uma região intrinsecamente desordenada cuja fosforilação por PKA leva à dimerização dos NBD. Aquando da síntese e enrolamento da CFTR no retículo endoplasmático, ocorre co-transducionalmente uma glicosilação que origina uma proteína imatura que será sujeita ao controlo de qualidade do retículo endoplasmático (ERQC). Encontrando-se corretamente enrolada, é transportada para o complexo de Golgi onde é concluída a glicosilação e alcançada a sua forma madura, que será depois transportada para a MP onde desempenhará a sua função. Até hoje, foram identificadas mais de 2100 variantes do gene CFTR, tanto patogénicas como não patogénicas. As variantes patogénicas podem comprometer o equilíbrio transepitelial de iões de diferentes formas. Atualmente, estas mutações estão agrupadas em 7 classes: Classe I inclui as mutações que prejudicam a produção de CFTR levando geralmente à degradação do mRNA (principalmente mutações nonsense); Classe II inclui mutações que resultam num enrolamento incorreto da CFTR e que levam à sua retenção pelo mecanismo de ERQC e subsequente degradação, reduzindo substancialmente o tráfego de CFTR para a membrana bem como a sua função. A p.Phe508del, a variante mais comum em indivíduos com FQ, é um exemplo de mutação de classe II; Classe III inclui as mutações que afetam o gating do canal; Classe IV inclui mutações que resultam na redução da condutância de Cle HCO3 - ; Classe V inclui mutações que levam à geração de mRNA aberrante por splicing alternativo; Classe VI inclui as mutações que resultam na destabilização da CFTR na MP, por aumento da endocitose ou diminuição da sua reciclagem de volta à MP; Classe VII inclui mutações conhecidas como irresgatáveis visto que inibem a síntese de mRNA e, consequentemente, de proteína CFTR. Quando a CFTR não se encontra funcional na MP, a absorção de fluidos e secreção de iões fica comprometida, o que leva á perda de homeostase transepitelial que resulta na produção de muco espesso. A presença de muco espesso e mais ácido que o normal compromete o normal funcionamento dos cílios resultando na obstrução das vias aéreas e no surgimento de infeções bacterianas recorrentes, capazes de desencadear respostas inflamatórias crónicas que levam à destruição progressiva do tecido pulmonar resultando eventualmente em insuficiência respiratória. A insuficiência respiratória é a principal causa de morbidade e mortalidade entre indivíduos com FQ. Só a partir de 2012, surgiram opções terapêuticas focadas não no controlo dos sintomas, mas sim na correção dos defeitos primários das variantes CFTR patogénicas – medicamentos chamados moduladores da CFTR. Os moduladores aprovados aumentam o enrolamento e o tráfego da CFTR (corretores) ou a abertura dos canais já presentes na MP (potenciadores). Atualmente estão aprovados pela Agência Europeia de Medicamentos (EMA) e pela Food and Drug Administration (FDA) dos EUA quatro moduladores da CFTR: os corretores lumacaftor (VX-809), tezacaftor (VX-661) e elexacaftor (VX-445), e o potenciador ivacaftor (VX-770). Em 2019, uma combinação de alta eficiência composta por elexacaftor, tezacaftor e ivacaftor, conhecida comercialmente como Kaftrio, foi aprovada para uso clínico. No entanto, estes medicamentos inovadores estão disponíveis apenas para indivíduos com um ou dois alelos p.Phe508del-CFTR. Mesmo para genótipos p.Phe508del-CFTR, estes medicamentos – a única terapêutica que visa a origem da patologia – têm custo bastante elevado, tornando necessário o desenvolvimento de novas terapias para indivíduos portadores de p.Phe508del-CFTR. Por outro lado, apesar de ser a variante mais comum, é de extrema importância o desenvolvimento de opções terapêuticas para indivíduos com FQ portadores de outras variantes. O nosso grupo identificou anteriormente a cinase 5 do receptor acoplado à proteína G (GRK5) como um novo regulador da p.Phe508del-CFTR. Nesse estudo, a regulação de p.Phe508del-CFTR pela GRK5 foi confirmada por meio de silenciamento com siRNAs e inibição com compostos inibitórios específicos. Foi observado que a inibição da GRK5 pode restaurar o tráfego de p.Phe508del-CFTR para a MP e apresenta um efeito aditivo a moduladores de CFTR usados atualmente. No entanto, a base molecular para a regulação de p.Phe508del-CFTR por meio de GRK5 é desconhecida. As cinases do recetor acoplado à proteína G (GRK) são serina/treonina cinases conhecidas por modularem a sinalização de recetores acoplados à proteína G (GPCR), através da sua dessensibilização. Este processo canónico é comum a todas as GRK (GRK1-7) e essencial para a proteção das células e tecidos contra a exposição prolongada a ligantes bem como sustentar a resposta fisiológica contínua a estímulos. A GRK5 está também envolvida noutros processos moleculares tais como: regulação da hipertrofia cardíaca por meio da fosforilação da histona desacetilase 5 (HDAC5), redução da inflamação pela fosforilação de NF-κB p105, aumento da polimerização e agregação de α-sinucleína pela fosforilação da mesma. Até recentemente, todos os inibidores de GRK5 disponíveis eram inespecíficos, inibindo também a GRK2. Alguns exemplos destes inibidores são o Sunitinib, um inibidor do recetor tirosina cinase aprovado pela FDA também capaz de inibir a GRK5, e o Ullrich 57, composto derivado da estrutura indolinona do Sunitinib. Os primeiros inibidores GRK5 seletivos e potentes foram desenvolvidos por Andrew D. White e pelo seu grupo, que geraram uma série de inibidores da GRK5 a partir do scaffold Ullrich 57. Dos inibidores gerados, os três mais seletivos e potentes foram CCG273463, CCG273441 e GRL018-21. Posto isto, o objetivo deste trabalho foi avaliar e caracterizar o resgate do tráfego e da função da p.Phe508del-CFTR aquando da inibição da GRK5, e verificar a existência de aditividade com os moduladores de CFTR VX-661 e VX-445. Para a inibição da GRK5, foi utilizado um inibidor seletivo, CCG273441, tanto sozinho como em combinação com os moduladores referidos. Os nossos resultados permitiram-nos entender melhor o funcionamento da via de sinalização de GRK5-CFTR e como a inibição de GRK5 é capaz de resgatar o tráfego e a função de p.Phe508delCFTR. Foi também possível confirmar a sinergia da inibição da GRK5 com moduladores de CFTR. Uma vez inibida a GRK5, a quantidade total de p.Phe508del-CFTR nas células aumenta, havendo assim mais CFTR disponível para ser corrigida pelos moduladores e consequentemente uma quantidade aumentada de CFTR funcional no MP. Em conclusão, os nossos resultados mostram que a GRK5 regula p.Phe508del-CFTR interferindo ao nível da produção e/ou degradação de CFTR.

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