Recovering neuronal function and promoting neuroprotection in diabetic retinopathy

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Modelling degenerative retinal mechanisms in 3D retinal organoids

Publication . Santos, Inês Mariana Abreu Aguiar Paz; Machado, Maria Luísa de Lemos; Amaral, Joana São José Dias

O olho humano é uma estrutura de importância extrema, associada à aquisição e interpretação de informação visual por meio de deteção luminosa, sendo formado pelo globo ocular e estruturas acessórias dotadas de capacidade de suporte e proteção. O globo ocular é, por sua vez, constituído pela túnica vascular, túnica fibrosa e pela retina, sendo esta última um tecido sensorial e organizado em diferentes camadas celulares com microcircuitos que trabalham em paralelo para decodificar informação visual. A retina humana é composta pelo epitélio pigmentar da retina, com grânulos de melanina que são capazes de absorver a luz que passa pela retina e providenciar uma maior qualidade de visão, e pela neuroretina. Esta última é uma estrutura com várias camadas associadas a cinco tipos celulares principais: células horizontais, bipolares, amácrinas, ganglionares e fotorrecetores, podendo estes ser de dois tipos distintos, cones ou bastonetes. A principal causa de perda de visão e defeitos visuais na espécie humana está diretamente relacionada com doenças da retina associadas à idade como é o caso do glaucoma ou da degenerescência macular em que ocorre perda de função e morte de tipos celulares específicos da retina, em associação com níveis altos de stress oxidativo, inflamação e disfunção mitocondrial. Curiosamente, nos últimos anos, têm sido estabelecidas correlações entre os mecanismos patofisiológicos e características distintivas das doenças da retina associadas à idade quando comparadas com doenças neurodegenerativas como a Doença de Parkinson. Para além de defeitos como uma diminuição da sensibilidade ao contraste espacial, acuidade visual reduzida, e dificuldades na deteção de cor, outras disfunções na retina de doentes com Parkinson têm vido a ser descritas na literatura, com a deposição de a-sinucleína e da sua forma fosforilada em células ganglionares, coincidente com as características distintivas associadas à patologia. Apesar das dificuldades relacionadas com o estudo da retina humana que se mantiveram por muitos anos devido à ausência de modelos representativos, a última década esteve associada a melhorias consideráveis nesse campo de estudo, com a obtenção de células estaminais pluripotentes induzidas e consequente desenvolvimento de modelos 3D, como é o caso de organoides, descritos como sendo capazes de recapitular a organização e sensibilidade à luz características da retina humana. Com este trabalho, pretendeu-se contribuir para um maior entendimento dos efeitos da expressão aumentada da a-sinucleína nos mecanismos de degeneração da retina, através do desenvolvimento de organoides de retina derivados de células pluripotentes induzidas obtidas de paciente. Os objetivos principais do projeto prenderam-se com a geração de organoides com uma linha celular derivada de um paciente de Parkinson e a sua subsequente caracterização a diferentes estadios de desenvolvimento, e posterior avaliação de diferenças na suscetibilidade dos mesmos e do impacto da triplicação da -sinucleína no processo degenerativo do organoide. Com esse intuito, os organoides foram gerados de acordo com o protocolo descrito por Capowski et al., usando uma linha celular de paciente de Parkinson, com a triplicação do gene da a-sinucleína (SNCA), e administrando um único pulso de proteína morfogénica óssea 4 (BMP-4) ao sexto dia de diferenciação. Para as experiências iniciais, três linhas celulares foram usadas como controlo (IMR90, RBi001e TC-Lab). Após confirmação da sua pluripotência, a avaliação da competência de geração dos organoides foi efetuada através de análise de tamanho aos dias 6, 30 e 70, bem como observação da eficiência de geração de vesículas de neuroretina e presença do epitélio pigmentar. Os organoides de paciente não revelaram qualquer alteração relevante, apresentando sinais de desenvolvimento semelhantes aos controlos e validando a linha celular de paciente como tendo capacidade de gerar organoides de retina viáveis. Tendo em conta a ausência de diferenças entre os controlos utilizados, o seguimento das experiências foi efetuado utilizando apenas a linha IMR90, e a caracterização celular e avaliação de alterações moleculares foram executadas maioritariamente através de métodos de imunofluorescência, Western-Blot e análise de RNA. As análises aos dias 80 e 120 de diferenciação revelaram que os organoides gerados com a linha de paciente mostraram sinais de organização semelhantes aos controlos, expressando diferentes tipos de marcadores associados às diversas populações celulares da retina, incluindo células ganglionares, amácrinas e progenitores de fotorrecetores. Com o decorrer da diferenciação, foi possível observar uma diminuição de células ganglionares, aumento de células amácrinas e migração de progenitores de fotorrecetores para a camada mais exterior dos organoides, indicando que os organoides de ambas as linhas seriam dotados de capacidade para recapitular o processo de retinogénse humana. Em seguida, foram analisados os níveis de a-sinucleína ao dia 80 e 120 de diferenciação, observando-se que os organoides derivados do paciente apresentaram níveis mais altos de mRNA e proteína quando comparados com os controlos, bem como uma maior intensidade de fluorescência. Adicionalmente, foi observada uma acumulação da forma fosforilada da a-sinucleína no resíduo Serina 129, por Western-Blot, característica vastamente associada à Doença de Parkinson. Posteriormente, foram investigados parâmetros como níveis de enzimas antioxidantes, expressão de marcadores inflamatórios e o estado da mitocôndria. As enzimas antioxidantes como a catalase (CAT) e superóxido dismutases (SODs) 1 e 2 foram avaliadas entre os dias 30 e 120 de diferenciação, e os nossos resultados revelaram um aumento dos seus níveis de mRNA e proteína, indicando uma potencial resposta a stress oxidativo. Adicionalmente, em organoides gerados com a linha de paciente, foram observados níveis de mRNA mais elevados de marcadores como a interleucina 6 (IL6) e a proteína quimiotática de monócitos-1 (MCP-1) aos dias 50, 80 e 120, coincidentes com uma maior resposta inflamatória. O estado da mitocôndria foi avaliado através da análise dos níveis de mRNA de membros da família do linfoma de células B 2 (BCL2), genes diretamente relacionados com a via mitocondrial e intrínseca de apoptose, em associação com o uso do corante lipofílico catiónico JC-1, capaz de se acumular na mitocôndria dependendo do seu potencial de membrana. Os nossos resultados aos dias 50, 80 e 120 de diferenciação revelaram um aumento significativo dos níveis de mRNA de BCL2, do regulador de apoptose BAX e do BCL2 antagonist/killer 1 (BAK1) em organoides de paciente quando comparados com os controlos, indicando uma possível disfunção da via mitocondrial de apoptose. Estes valores foram acompanhados de um rácio agregado/monómero de JC-1 diminuído entre os dias 120 e 150, indicando uma despolarização da membrana mitocondrial e um potencial de membrana reduzido em organoides de paciente. Como anteriormente descrito na literatura, a presença de fluorescência localizou-se predominantemente na área mais exterior do organoide, coincidindo com a localização de fotorrecetores. Finalmente, foi do interesse deste trabalho proceder à avaliação de células fotorrecetoras. Para o propósito, foram usadas técnicas de deteção de imunofluorescência em organoides com 180 dias, localizando cones e bastonetes. Contrariamente aos controlos, que manifestaram a presença destas células na zona externa do organoide, os organoides derivados do paciente, revelaram ausência de ambos os tipos de fotorrecetores. Em suma, os resultados obtidos indicam que a triplicação da SNCA poderá atuar como uma sobrecarga para as células, promovendo degeneração da retina através de mecanismos consistentes com as características distintivas da Doença de Parkinson e que isto é fidedignamente reproduzido em organoides 3D de retina. Este trabalho suporta a utilização dos organoides como um modelo interessante para o estudo dos mecanismos moleculares associados com a sobre expressão de a-sinucleína e as suas implicações em doenças degenerativas da retina. Adicionalmente, pode também validá-los como uma ferramenta para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas dirigidas e inovadoras contra o stress oxidativo e a degeneração induzidos pela a-sinucleína ou por outras condições patológicas que partilham as mesmas características.

2022-02-18Dissertação de mestrado

Acesso aberto

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Entidade financiadora

Fundação para a Ciência e a Tecnologia

Programa de financiamento

9471 - RIDTI

Número da atribuição

PTDC/MED-PAT/29656/2017