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Projeto de investigação
Interplay between innate and acquired immune response at the basis for Multiple Sclerosis cognitive deficits
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Cannabinoid type 2 receptor inhibition enhances the antidepressant and proneurogenic effects of physical exercise after chronic stress
Publication . Rodrigues, Rui S.; Moreira, João B.; Mateus, Joana; Barateiro, Andreia; Paulo, Sara L; Vaz, Sandra H.; Lourenço, Diogo M.; Ribeiro, Filipa; Soares, Rita; Loureiro-Campos, E.; Bielefeld, P.; Sebastião, Ana M; Fernandes, Adelaide; Pinto, L.; Fitzsimons, C. P.; Xapelli, Sara
Chronic stress is a major risk factor for neuropsychiatric conditions such as depression. Adult hippocampal neurogenesis (AHN) has emerged as a promising target to counteract stress-related disorders given the ability of newborn neurons to facilitate endogenous plasticity. Recent data sheds light on the interaction between cannabinoids and neurotrophic factors underlying the regulation of AHN, with important effects on cognitive plasticity and emotional flexibility. Since physical exercise (PE) is known to enhance neurotrophic factor levels, we hypothesised that PE could engage with cannabinoids to influence AHN and that this would result in beneficial effects under stressful conditions. We therefore investigated the actions of modulating cannabinoid type 2 receptors (CB2R), which are devoid of psychotropic effects, in combination with PE in chronically stressed animals. We found that CB2R inhibition, but not CB2R activation, in combination with PE significantly ameliorated stress-evoked emotional changes and cognitive deficits. Importantly, this combined strategy critically shaped stress-induced changes in AHN dynamics, leading to a significant increase in the rates of cell proliferation and differentiation of newborn neurons, overall reduction in neuroinflammation, and increased hippocampal levels of BDNF. Together, these results show that CB2Rs are crucial regulators of the beneficial effects of PE in countering the effects of chronic stress. Our work emphasises the importance of understanding the mechanisms behind the actions of cannabinoids and PE and provides a framework for future therapeutic strategies to treat stress-related disorders that capitalise on lifestyle interventions complemented with endocannabinoid pharmacomodulation.
New in vitro model of microglia derived from human PBMCs to unravel their contribution in neurodegenerative disorders
Publication . Costa, Inês Sofia Tomaz da; Borralho, Adelaide Maria Afonso Fernandes; Macedo, Andreia Pereira Barateiro
A microglia são células imunológicas altamente especializadas do sistema nervoso central (SNC) e as únicas células imunológicas que residem permanentemente no SNC. Elas representam a principal população de imunidade inata dentro do SNC, compreendendo aproximadamente 10 a 15% de toda a população de células da glia. Durante o desenvolvimento e ao longo da vida, estas células desempenham uma variedade de funções importantes para o bem-estar do cérebro. Elas regulam a plasticidade sináptica, as funções homeostáticas e a atividade imunológica, sendo também capazes de desempenhar rapidamente qualquer uma dessas funções de acordo com as necessidades fisiológicas ou patológicas. Em lesões no SNC, a microglia é responsável pela fagocitose e eliminação de células mortas, microorganismos e agregados proteicos, além de outros antígenos que possam prejudicar o SNC. Em resposta a stresses ambientais ou estímulos, como agregados de proteínas, células apoptóticas e detritos de mielina, a microglia torna-se ativa e pode modular várias respostas celulares, movendo-se em direção ao local da lesão. Esta ativação, comummente designada de microgliose, pode desencadear várias respostas da microglia, incluindo um aumento na capacidade de apresentação de antígenos, a capacidade de se transformar em células altamente fagocíticas, a aptidão de regular atividades neuronais devido ao contato direto com terminações sinápticas ou a indução de mediadores imunológicos. Devido a essas diversas funções, a microglia é altamente flexível e capaz de adotar diferentes fenótipos, tal como fenótipos pró-inflamatórios e anti-inflamatórios. O fenótipo pró-inflamatório, é geralmente induzido por estímulos prejudiciais, leva a microglia a produzir e a libertar citocinas pró-inflamatórias, que estão associadas ao processo de desmielinização e degeneração neuronal. Por outro lado, o fenótipo anti-inflamatório, ocorre após a exposição a citocinas inflamatórias. Neste fenótipo, a microglia liberta vários fatores anti-inflamatórios. Essa microglia também desempenha um papel na fagocitose de detritos celulares, promovendo o processo de cicatrização regenerativa e ajudando a sobrevivência dos neurónios por meio dos fatores neurotróficos. No entanto, vários estudos sugerem que durante a doença pode ocorrer a disfunção da microglia contribuindo para os processos neurodegenerativos e acelerar a progressão de várias doenças do SNC, diminuindo a eliminação de detritos celulares e, portanto, comprometendo a conectividade cerebral.
A esclerose múltipla (EM) é uma doença neuroinflamatória crónica, caracterizada pela infiltração do sistema imunológico no SNC devido à disfunção da barreira hematoencefálica (BHE). Esta resposta imunológica danifica a bainha de mielina que envolve os axónios, levando a uma desmielinização progressiva, culminando eventualmente na degeneração axonal e morte neuronal. A neuroinflamação exacerba-se como consequência da degeneração neuronal, desencadeando a produção e libertação de citocinas pró-inflamatórias pelas células gliais do SNC. Por meio da ativação pró-inflamatória, a microglia desempenha um papel crítico em vários processos, incluindo a fagocitose da mielina, apresentação de antígenos às células T e libertação de citocinas pró- e anti-inflamatórias em áreas de lesão ativa, promovendo a remielinização dos axónios.
A doença neurodegenerativa mais comum é a doença de Alzheimer (DA), onde a sua patologia envolve o desenvolvimento de placas compostas pelo péotido amiloide-β (Aβ) extracelular. A presença de Aβ ativa a microglia de forma pró-inflamatória, sendo esta responsável por eliminar tanto depósitos solúveis quanto insolúveis de Aβ e prevenir a acumulação de placas existentes, minimizando assim a sua potencial neurotoxicidade. Contudo, a desregulação das vias de sinalização da microglia ao nível das sinapses leva a uma resposta neuroinflamatória inadequada e à inadequada fagocitose das placas de Aβ. Adicionalmente, a acumulação de Aβ interrompe as interações entre os neurónios e as células gliais, o que leva a uma redução das transmissões sinápticas.
Para investigar o papel da microglia na patogénese das doenças neurodegenerativas, o modelo de microglia deve refletir um inicio de estado de repouso, permitindo a caracterização das reações da microglia a estímulos associados à patologia, como o Aβ e detritos de mielina. Estão descritos na literatura inúmeros estudos onde foram utilizados modelos in vivo de roedores para investigar fenótipos e funções da microglia, contudo a maioria dos ensaios clínicos baseados em animais acaba por falhar, uma vez que as assinaturas transcriptomicas da microglia são diferentes entre roedores e humanos. No entanto, estudar a microglia humana é difícil devido à raridade e à dificuldade de obtenção de células primárias a partir de tecido do SNC humano fetal ou adulto. Modelos de microglia derivadas de células estaminais de doentes surgiram como uma ferramenta aprimorada para uma tradução clínica eficaz, evitando as desvantagens das técnicas de isolamento e imortalização. No entanto, a diferenciação in vitro de células estaminais pluripotentes induzidas (iPSC) em microglias é difícil devido ao processo de reprogramação demorado e caro. A geração de microglia a partir de outras células, tais como as células mononucleares do sangue periférico (CMSP), pode ser uma possibilidade para superar as limitações existentes em outros modelos in vitro e in vivo.
O objetivo do presente trabalho foi criar um modelo inovador de microglia in vitro que preservasse as características e respostas da microglia humanas, permitindo um estudo mais profundo do seu papel em doenças neurodegenerativas. As CMSP foram isoladas a partir de sangue periférico de adultos voluntários saudáveis, através de centrifugação por gradiente de densidade utilizando Ficoll. A microglia induzida (iMG) foi diferenciada a partir da cultura de CMSPs com recurso aos fatores de crescimento IL-34 e GM-CSF, durante 14 dias. Esta diferenciação foi validada pela caracterização celular onde exibiram morfologia ramificada típica de microglia em repouso e onde expressaram marcadores específicos de microglia TMEM119 e P2RY12. Esses resultados demonstram que as iMGs compartilham algumas características comuns das microglias humanas, sendo um método mais rápido do que aquele derivado das iPSCs, e adicionalmente, são obtidas recorrendo a uma amostra de sangue, que é considerado um método não invasivo amplamente aceite na investigação clínica.
Seguidamente, avaliámos também se estas células poderiam ser usadas para investigar a fisiopatologia microglial associada a doenças cerebrais como a DA e a EM. O nosso estudo explorou as respostas das iMGs a estímulos associados a doenças, como Aβ e detritos de mielina (DM), para mimetizar as patologias da DA e da EM, respetivamente. Notavelmente, a iMG fagocitou eficazmente tanto o Aβ como os DM, fazendo a transição para um estado pró-inflamatório com morfologia alterada e expressão de marcadores pró-inflamatórios. Este modelo celular tem assim o potencial de elucidar vias relevantes da microglia, aprofundando a compreensão dos processos neurodegenerativos.
O modelo de iMG oferece uma plataforma valiosa para investigar o impacto destas células nas condições neurodegenerativas e comparar as respostas microgliais entre condições saudáveis e patológicas, bem como o potencial para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas. Compreender as complexidades do comportamento da microglia e as suas interações com outras células cerebrais poderá melhorar a compreensão das doenças neurodegenerativas e abrir caminhos para tratamentos inovadores.
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Entidade financiadora
Fundação para a Ciência e a Tecnologia
Programa de financiamento
3599-PPCDT
Número da atribuição
PTDC/MED-PAT/2582/2021