Neuronal circuits underlying egg laying behavior in the fruit fly

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Neuronal circuits of egg laying behaviour in Drosophila melanogaster

Publication . Santos, Sara Ferreira Lopes Marques dos; Vasconcelos, Maria Luísa; Sucena, José Élio da Silva

Uma questão central em neurociência comportamental é como é que o sistema nervoso central produz uma sequência de ações motoras para induzir comportamento, após a decisão para a sua execução ter sido sinalizada pelo cérebro. Para responder a esta pergunta, o organismo modelo Drosophila melanogaster tem sido amplamente utilizado, não só pela facilidade de ser mantido em laboratório e ferramentas genéticas disponíveis, mas também porque tem um sistema nervoso relativamente simples que é capaz de executar comportamentos complexos. Um desses comportamentos é o comportamento de oviposição, que oferece uma excelente oportunidade de explorar a arquitetura do controlo motor, pois é um comportamento inato, coordenado no tempo, sincronizado com o estado interior do animal e flexível para o animal ser capaz de superar mudanças inesperadas no ambiente. Assim, o comportamento de oviposição tem um impacto profundo na sobrevivência e fitness das espécies ovíparas. Em Drosophila, este comportamento é composto por um ciclo de fases que incluem deposição do ovo (egg deposition), contorções abdominais (abdominal contortions) e exploração (exploration), subdividido em sete comportamentos específicos. Estes sete comportamentos incluem: o contacto do ovipositor, uma estrutura em forma de tubo temporariamente expelida, com o substrato (ovipositor contact), enterrar o ovipositor (burrowing), fazer força para a expulsão do ovo (egg pushing), curvar o abdómen para cortar a ligação com o ovo posto (abdomen curling) e a limpeza do abdómen (grooming terminalia), durante a fase de deposição do ovo; alongamento (abdominal elongation) seguido de encurtamento (abdominal scrunch) do abdómen com ondulações e expulsão do ovipositor, durante a fase das contorções abdominais; extensão da probóscide (proboscis extension), contacto e enterrar o ovipositor no substrato, durante a fase de exploração. Todos estes elementos comportamentais são executados para promover a deposição do ovo, a ovulação e a degustação do substrato, respetivamente. É através do sistema nervoso central que a mosca consegue executar os comportamentos motores. Este é constituído pelo cérebro e pelo cordão nervoso ventral, uma estrutura análoga à medula espinal dos vertebrados. A informação sensorial do ambiente é recolhida e transmitida ao cérebro, onde a decisão para a execução do comportamento é tomada. A decisão é depois transmitida ao cordão nervoso ventral, que é constituído por unidades torácicas que controlam os movimentos das asas e patas e, na ponta, o gânglio abdominal, o qual induz à execução coordenada dos comportamentos reprodutivos. Apesar dos esforços, continua por se determinar como os neurónios do gânglio abdominal induzem os circuitos motores que controlam os comportamentos específicos de oviposição. A atividade de neurónios onde o fragmento H3 de um promotor de doublesex induz expressão – neurónios H3 – mostrou comportamentos de oviposição e o seu padrão de expressão mostrou corpos celulares no gânglio abdominal. Assim sendo, o presente estudo teve como objetivo determinar o papel dos neurónios H3 na oviposição (Objetivo 1) com o intuito de encontrar uma associação mais profunda entre o gânglio abdominal e os vários comportamentos de oviposição. Assim, testámos o efeito da ativação dos neurónios H3 através da expressão neuronal de canais sensíveis à luz vermelha CsChrimson, usando o sistema binário de expressão lexA-lexAop e enquanto gravámos os comportamentos em vídeo (Objetivo 1.1); usámos novamente o sistema lexA-lexAop para testar a contribuição dos neurónios H3 para a oviposição, através da expressão neuronal de canais potássio Kir2.1 que efetuam silenciamento, enquanto analisámos o comportamento e contámos o número de ovos postos (Objetivo 1.2). Para ambas as experiências usámos moscas sem promotor e com o sistema lexA-lexAop completo como controlo. No fim, caracterizámos o perfil de neurotransmissores dos neurónios H3 (Objetivo 2). Para isso usámos a técnica de co-localização, em que o sistema lexAlexAop foi usado para expressar uma proteína de fluorescência vermelha nos neurónios H3 e, ao mesmo tempo, o sistema de expressão GAL4-UAS foi usado para expressar a proteína de fluorescência verde nos neurónios que expressam transportador de glutamato vesicular, acetiltransferase de colina ou descarboxilase 1 de ácido glutâmico, que indicaram se os neurónios eram glutamatérgicos, colinérgicos ou GABAérgicos, respetivamente. Assim, os neurónios H3 que expressam cada um dos neurotransmissores, foram identificados através da sobreposição das cores escolhidas. O padrão de expressão dos neurónios H3 mostrou 13 corpos celulares no gânglio abdominal, que acreditamos estarem relacionados com comportamentos de oviposição e marcação dispersa no cérebro e restante cordão nervoso ventral, que duvidamos estarem relacionados com a execução dos comportamentos de oviposição. A ativação dos neurónios H3 levou à execução de comportamentos que anotámos como Abdominal Bending – curvatura no abdómen, em que a ponta final fica virada para o substrato; Abdominal Hook – o abdómen está direito na sua parte mais anterior e depois curva na ponta posterior em direção ao substrato; Ovipositor Extrusion – extrusão do ovipositor; Long Abdomen – aumento visível do comprimento do abdómen; e Round Abdomen – encurtamento do abdómen formando uma bola. Vimos que estes comportamentos eram incompletos, sendo parecidos com o início de comportamentos de oviposição apresentados por fêmeas grávidas, nomeadamente os comportamentos pertencentes à fase das contorções abdominais (Abdominal Hook, Ovipositor Extrusion e Round Abdomen). Descobrimos que a execução dos comportamentos de ativação podem ter a contribuição do cérebro ao analisarmos fêmeas após a remoção da cabeça. A análise do padrão de expressão e atividade dos neurónios H3 nos machos levaram à conclusão de que estes neurónios são sexualmente dimórficos, com dois dos comportamentos de ativação a serem específicos da fêmea (Ovipositor Extrusion e Round Abdomen). O silenciamento dos neurónios H3 levou a uma abolição de deposição de ovos em 78% das moscas, com disrupção dos elementos motores associados aos comportamentos de oviposição das três fases. As restantes moscas que puseram ovos foram capazes de realizar os comportamentos de oviposição. A redução drástica na oviposição não estava relacionada com problemas de acasalamento nem de oogénese. Ao analisarmos como a oviposição das moscas H3 silenciadas evoluía ao longo do tempo, descobrimos que todas as moscas eram capazes de pôr ovos, no entanto com um atraso, o que nos levou a questionar a influência do protocolo de privação de oviposição que executamos antes das experiências para induzir a deposição dos ovos. Assim, testámos se as moscas teriam um problema a reiniciar a oviposição depois de esta ter sido suspensa ou se teriam um problema em reter os ovos durante a privação. A partir deste ponto, em todas as experiências observámos que as moscas H3 silenciadas colocaram igual (1 hora) e superior (de 6 a 24 horas) quantidade de ovos, comparadas com o controlo. Assim, observámos que os resultados de menor frequência de oviposição das moscas H3 silenciadas são pouco robustos, o que nos mostrou um possível novo papel dos neurónios H3. Assim, o silenciamento dos neurónios H3 revelou que estes não são necessários para a execução dos comportamentos de oviposição, pois a inibição da atividade neuronal levou ao aumento dos eventos de deposição do ovo ao longo do tempo, comparativamente com o controlo. Este resultado indica que os neurónios H3 podem estar envolvidos num mecanismo de supressão de oviposição. Como as moscas controlo têm uma redução mais acentuada, ao longo do tempo, de oviposição do que as silenciadas, levou-nos a especular que os neurónios H3 podem estar envolvidos num mecanismo de controlo da densidade de ovos no ambiente. Em adição, ao juntarmos os resultados das experiências de ativação e silenciamento, acreditamos que os neurónios H3 podem estar a suprimir a expulsão do ovo no fim das contorções abdominais, até o local ideal para a descendência ser encontrado. Durante a experiência de silenciamento obtivemos informações importantes com interesse para futuras experiências com foco em oviposição. Observámos que para experiências de curta duração (ex. com captura de vídeo), usar o protocolo de privação de oviposição é vantajoso por incitar as fêmeas a depositarem mais ovos no novo ambiente. No entanto, para experiências mais longas (ex. contagem de ovos após 24 horas), o protocolo de privação não é necessário, permitindo poupar tempo e material utilizados para esse fim. Esta experiência também nos mostrou que usar comida em experiências que não seja necessário ver através do substrato, aumenta a frequência de oviposição, comparando com substrato de agarose (1%). Por fim, ao analisarmos o perfil de neurotransmissores dos neurónios H3, vimos que estes serão certamente colinérgicos. Este trabalho cria a oportunidade para melhor entender a comunicação ascendente e descendente com o cérebro e aumenta o conhecimento sobre a extensão neuronal e conetividade entre populações de neurónios subjacentes ao comportamento de oviposição, servindo de base para a descoberta de como diferentes circuitos estão conectados para coordenar comportamento e contribuindo para elucidar como as ações motoras estão codificadas no sistema nervoso central.

2024Dissertação de mestrado

Acesso aberto

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Entidade financiadora

Fundação para a Ciência e a Tecnologia

Programa de financiamento

Concurso de Projetos IC&DT em Todos os Domínios Científicos

Número da atribuição

PTDC/BIA-COM/2962/2021